可结合纤维素的五聚体化单链抗体的异源表达与纯化.pdf

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1、万方数据ADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterinscienceHeterologousExpressionandPurificationofPentamerizedScFvwithCellulose—bindingCapacityMasterCandidate：LiuYutingMajor：Supervisor：BiologyXinHuaweiWuhanUniversityofSciencea

2、ndTechnologyWuhan，Hubei430065，P．R．ChinaMay,2016武湫大学／一万方数据研究生学位论文创新性声明一本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。除了文中已经注明引用的内容或属合作研究共同完成的工作外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：叁I玉蓬日期：越!＆：垒：半研究生学位论文版权使用授权声

3、明本论文的研究成果归武汉科技大学所有，其研究内容不得以其它单位的名义发表。本人完全了解武汉科技大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向有关部门(按照《武汉科技大学关于研究生学位论文收录工作的规定》执行)送交论文的复印件和电子版本，允许论文被查阅和借阅，同意学校将本论文的全部或部分内容编入学校认可的国家相关数据库进行检索和对外服务。黼撇：垒】王丝指导教师签名：垒竺生日期：出2＆：￡：迸万方数据摘要目的：构建可结合纤维素的五聚体化单链抗体原核表达载体系统，并进行融合蛋白的表达与纯化。方法：1．载体构建：利用

4、基因克隆技术通过PCR获得大豆胰蛋白酶抑制剂单链抗体基因片段，并将所得DNA片段分别克隆到含有纤维素结合结构域的原核表达载体pET37b及不含有纤维素结合结构域的载体pET22b上；同时利用PCR技术扩增出大肠杆菌VTlB五聚体化结构域基因片段，再将五聚体化结构域片段插入含有蛋白酶抑制剂单链抗体基因的载体上，获得含有纤维素结合结构域．五聚体化结构域．单链抗体一多组氨酸标签的融合蛋白的原核表达构建体。2．蛋白表达锵所获得的含有目的基因的载体转入大肠杆菌BL21表达菌株中，用0．5mM的IPTG进行诱导。诱导表达一定

5、时间后，收集细胞、超声破碎，收集细胞裂解液和沉淀，鉴定目的蛋白的表达。分离包涵体、用8M尿素溶解包涵体，获得含有目的蛋白的包涵体溶解液。3．蛋白纯化：预处理Ni．NTA树脂柱，将收集的含有目的蛋白的细胞裂解液或包涵体溶解液与Ni．NTA树脂柱进行结合，洗去部分杂蛋白，最后用含有0．4M咪唑的洗脱液将蛋白从用Ni．NTA树脂上洗脱下来，鉴定并保存洗脱下来的初步纯化的目的蛋白。4．蛋白复性：用透析的方法，将尿素变性后的蛋白通过逐步去除尿素，降低变性剂浓度，使恢复蛋白活性。5．亲和层析：将复性的蛋白与纤维素柱共同孵育，

6、利用亲和层析的原理，目的蛋白可与纤维素结合，洗去杂蛋白，将目的蛋白从纤维素柱中洗脱下来，经SDS—PAGE电泳后，用考马斯亮蓝法染色，比较蛋白与纤维素的亲和力。结果：1．获得多个含有大豆胰蛋白酶抑制剂单链抗体的原核表达载体，包括1)不含有五聚体化结构域、不含有纤维素结合结构域的蛋白酶抑制剂单链抗体表达载体pET22b．1X；2)含有五聚体化结构域、不含有纤维素结合结构域的蛋白酶抑制剂单链抗体表达载体pET22b．260；3)不含有五聚体化结构域、含有纤维素结合万方数据结构域的蛋白酶抑制剂单链抗体表达载体pET37

7、b一1X；及4)既含有五聚体化结构域、也含有纤维素结合结构域的蛋白酶抑制剂单链抗体表达载体pET37b．260。2．经诱导得到大量目的蛋白，大部分目的蛋白大量表达在包涵体沉淀中，少部分在上清液中。3．通过Ni．NTA树脂可对目的蛋白进行纯化，但仍然存在大量非特异性蛋白。4．纤维素柱可与有活性的蛋白结合，经过纤维素再次纯化，目的蛋白获得进一步纯化，得到纯度较高的目的蛋白。5．五聚体化融合蛋白对纤维素的亲和力可增强2倍，可进一步提高目的蛋白的纯度。结论：1．纤维素结合结构域．五聚体化结构域一单链抗体融合蛋白可以在大肠

8、杆菌中获得高效表达；2．单链抗体本身及各种融合蛋白在大肠杆菌表达系统中的可溶性受到限制，通过包涵体变性剂处理、纯化并复性操作，融合蛋白的活性可恢复；3．纤维素可纯化可结合纤维素的五聚体化单链抗体；4．五聚体化结构域可增强可结合纤维素的单链抗体融合蛋白与纤维素之间的亲和力，提高纯化效率。关键词：五聚体化单链抗体；纤维素结合结构域；大豆胰蛋白酶抑制剂；亲和层析II万方数据Ab