单链抗体酶人源化的研究

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1、吉林大学硕士学位论文原创性声明本人声明:所呈交的硕士学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名哗髦人鲜日期:2003年5月15日关于论文使用授权的说明本人同意学校有权保留并向国家有关部门送交学位论文的复印件，允许论文被查阅和借阅。不同意学校及国家有关机构可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手

2、段保存论文。论文作者签名:肠ok}指导教师签“:lf}k日期:“了-日期:1&-03一‘一夕I&,冲水A学不口.士学1立1仑万七杨文月氏提要利用计算机模拟技术对比鼠源抗体与人源相似抗体的结构，并对鼠源抗体进行定点突变，改造其一级结构，使其尽可能与人源抗体相似而减小其抗原性。由于抗体CDR附近的一些氨基酸对于该区的稳定非常重要，一旦改变，很可能造成CDR的结构改变，进而影响抗体的活性，所以我们对这些氨基酸与人相似抗体该部位氨基酸同时保留，这样就形成了一个容量约为500的小型人源化单链抗体库，然后按细菌的密码子设计出整个单链抗体库的基因序列，再

3、将该基因库连入噬菌粒载体.通过噬菌体展示筛选技术筛选亲和活性高的克隆。我们将筛选得到的基因克隆转移到适当的可溶性表达载体中，转化大肠杆菌进行表达，收集并裂解菌体，采集上清，利用Ni2+金属鳌合树醋对样品进行纯化处理(亲和层析)，然后利用WesternBlotting,ELISA,点印记(dotbloting)等方法对目的蛋白进行鉴定。利用化学修饰方法对经鉴定确认的目的蛋白进行硒化，并用间接法测定其GPX活性。官林J悦学硕州卜攀位论二七1+202RS日FSeSRFSeOZHEse0月R'OOH尤RSHESeH-RSSRR'00日在乒乓机制中，

4、催化循环始于酶的还原态(E-SeH)，经氢过氧化物氧化为亚硒酸形式(E-SeOH),E-SeOH被GSH还原为硒硫化物E-Se-SG,再经另分子GSH还原为初态(E-SeH)。其催化机制可表示如下:ROOH十云贷万-，云交口刀十R(万1(为ESeOH十GSH一止‘今ESeH十GSSG(4)在整个催化循环中，最快的步骤是E-SeH被ROOH氧化，而E-Se-SG转化为ESeH形式为反应的限速步骤['a7。事实上，活性中心的硒代半眺氨酸位于蛋白质疏水性凹槽较暴露处，这使得各种类型的氢过氧化物都能接近它而使它被快速氧化，这也是此酶对各种类型氢过氧

5、化物不表现出底物专一性的原因。天然GPX在催化动力学上符合Dalziel方程(111,1131Eo=of(6)V[RSH]+(DZ/[ROOH](E，为GPX初始浓度，V为反应速度，41,CD:为Dalziel常数。)GPX的动力学方程还可以用Segel形式表示〔1410V=—一凡[GSH][ROOH]K,aw[ROOH]+KmH,o，[GSH]+[ROOH][GSH](})cv...为最大反应速度，K.为Michaelis常数。)吉林1-1学石口士学位论文杨文兔当将种底物浓度固定，而改变另一种底物的浓度时，其双倒数曲线为组平行线。1.3G

6、PX的生物学效应生物体在正常生理条件下将氧还原为H2O获取生物能，一般要经过仇一Oz-'->玩02--+2跳O过程，期间产生的活性氧诸如Oz--,H202,-OH和单线态氧除满足机体本身代谢需要(如前列腺素合成，胶原蛋白合成等)外，不可避免会作用于其它生物分子(如造成脂质过氧化，引起生物膜损伤，基因突变等)，从而引起机体病变。GPX的作用是和SOD,CAT起，共同清除机体活性氧，减轻和阻止其过氧化作用:机体对活性氧OZ一的第一道防线是SOD，它将OZ一转化为过氧化氢和其它氢过氧化物;第二道防线是CAT和GPX，其中CAT可清除过氧体系中的H

7、202，而GPX分布在细胞的胞液和线粒体中，可同时清除H202和氢过氧化物。到目前为止，又相继在哺乳动物体内发现了另外三种GPX，即磷脂氢谷耽甘肚过氧化物酶(phGPX)["[、血浆谷肤甘肤过氧化物酶pGPX[161和消化系统谷胧甘肤过氧化物酶(giGPX)["l。谷耽甘肤是此类酶的共同专一性底物，而氢过氧化物则是其非专一性底物。不同种类的GPX分子量和比活性有所不同(Table4-1)，现对比如下:Table1一1PropertiesofGPXfromdifferentspecies:SubunitsmolecularSubunitAct

8、ivityforH20,Ref.Speciesweight(KD)number(U/Eunol)J216[18j任21左31.3[l8]21.5工9︸自J通任主2.1[l2jgi