DB22∕T 3087-2019 猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株鉴别qPCR法.pdf

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1、ICS11.220B41DB22吉林省地方标准本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T3087—2019猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株鉴别qPCR法本标准仅供内部使用不得翻印IdentificationofclassicalandvariantstrainsofporcineepidemicdiarrheavirusReal-timePCRmethod2019-12-25发布2020-02-01实施吉林省市场监督管理厅发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T3087—2019本标准仅供内部使用不得翻印前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草

2、。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：吉林农业大学。本标准主要起草人：张双、王开、郭衍冰、裴志花、黄海龙、朱俊辉、李响、胡桂学。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T3087—2019本标准仅供内部使用不得翻印猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株鉴别qPCR方法1范围本标准规定了猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株qPCR法技术的要求。本标准适用于猪流行性腹泻病毒经典毒株与变异毒株的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其

3、最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫GB/T36871猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒多重RT-PCR检测方法3缩略语本标准仅供内部使用不得翻印下列缩略语适用于本文件。qPCR:实时荧光定量PCR(Real-timepolymerasechainreaction)RNA：核糖核酸(ribonucleicacid)cDNA:互补脱氧核糖核酸(complementarydeoxyribonucleicacid)Rnase：核糖核酸酶(r

4、ibonuclease)Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4原理在普通聚合酶链反应的基础上，加入一条特异性的荧光探针。该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接受到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。5试验条件5.1生物安全措施所有培养物和废弃物的处置应符合GB19489的规定。5.2防污染措施1DB22/T

5、3087—2019防止污染措施应符合GB/T27401的规定。6试剂和材料本标准仅供内部使用不得翻印6.1试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中一级水的要求。6.1.1RNA提取试剂盒。6.1.2反转录试剂盒。6.1.3Rnasefreewater。6.1.4ROXReferenceDyeⅡ。6.1.5qPCRProbeMasterMix。6.1.6阳性对照，以猪流行性腹泻病毒经典毒株CV777（GenBank：AF353555.1）和变异毒株HB-2012-1（GenBank：JX435302.1）的cDNA或含目的片段的阳性质粒。6.

6、1.7阴性对照，Rnasefreewater。6.2耗材6.2.1无RNase离心管，0.2mL，1.5mL。6.2.2无RNase吸头，10μL。6.2.3吸头，10μL，200μL，1000μL。本标准仅供内部使用不得翻印6.2.4qPCR反应管，根据qPCR仪选配。6.3引物和探针表1qPCR的引物序列和浓度序列浓度扩增片段大小引物和探针名称5’―3’pmol/µLbp上游引物FAYTTTAGGCGGTTCTTTTC20下游引物RARATACCATGAACGCCACT20135探针CHEX-GCAGTTGTYGYACTGGGCGGTT-TAMRA10探针VFAM-GCCG

7、TCGTYGYTTTGGGTGGTT-TAMRA107仪器7.1高速冷冻离心机，12000r/min以上。7.2可调移液器，最大量程为10μL，200μL，1000μL。7.3恒温水浴锅，控温范围为室温至100℃。7.4冰箱，-20℃。7.5多通道荧光定量qPCR扩增仪。8样品样品的采集和处理应符合GB/T36871的规定。2DB22/T3087—20199操作步骤9.1RNA本标准仅供内部使用不得翻印提取和反转录使用RNA提取试剂盒（6.1.1）提取样品RNA后，按照反转录试剂盒(6.1.