拟南芥转基因注意事项一.doc

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1、拟南芥转基因注意事项一By aqiao发表于2009-2-2718:39:00 1推荐材料选择：拟南芥中最常见的3种生态型(Columbia、Landsberg、Wassilewskija)的野生型Columbia基因组信息已测。 拟南芥最适温度是23度左右培养基可以直接用MSph7.0左右拟南芥转到光照培养箱中培养长势会好些种子消毒：拟南芥的经典表面消毒程序是：70％酒精1－5min，10％次氯酸钠15min，无菌水彻底漂洗5次。酒精30秒足够了外加10%~15%漂白液1分半也足够了保持光照150mm以上如果不是在培养皿中萌发种子的话，而是在小的pots里萌发的

2、，切记上面盖germinationdome或者用保鲜膜包好，不过要做好通风措施 温度和光照都很重要!也可以这样：75%的消毒一分钟，70%的再消毒两次1分钟，这样足以。拟南芥的生长条件，最好是，长日照，60-70%的湿度，22摄氏度左右。光照要够。温度25左右,光照要充足.转化实验　　选取饱满的拟南芥种子，种在花盆中，置于短日照（10h以下）温室中培养3周后转放到长日照条件下（光照12h以上）诱导抽苔开花。开花时用剪刀切去莲座叶以上主花轴（此时植株高约10cm），以促进次生花轴抽苔。剪切后7～9　d用作转化实验(此时植株高约10～15　cm,最大花序已产生第1个角

3、果,转化实验前一天停止浇水)。作转化实验时，用抽真空方法［6］将含有GUS基因和新霉素磷酸转移酶基因的载体转入拟南芥的花序中。也可用其它抗生素抗性基因作为选择标记。鉴于一般实验室不具备自制基因载体的条件，建议向有条件的实验室索取。操作过程是：（1）将含有载体的土壤农杆菌接种在含卡那霉素的培养基中培养至OD600　nm为1.2～1.8。(2)将培养物分装在400ml的烧杯中，置于真空罐中抽真空至培养液冒泡为止。(3)将上述准备好的拟南芥植株倒插入培养液中，确保所有的花都浸在农杆菌培养液中，莲座叶与培养液之间距离2cm，抽真空0.5h。(4)将植株连同花盆取出，用塑料

4、袋套住，并封口，侧放在培养室中。2d后花盆直立，去掉塑料袋；生长约4周时角果变黄，再用纸袋将植株套住，侧放；1周后剪下植株，收种子，干燥1周后放到4℃的冷室中。2d后将种子放在含有50mg.L－1卡那霉素的MS培养基上，生长约1周，凡是转化的植株，其叶片大而绿，未转化的植株叶片小而黄，很易区分开。同时按照文献5的方法检测GUS活性,以检验转基因的表达情况。抽真空法的转化率极高，以供试植株为单位计算的转化率达100%。另外，此法操作简便，很适宜于为学生开设转化实验。其不足之处是，迄今此法只适用于对拟南芥的转化。收藏到:[新浪ViVi][365Key][YouNote

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