死活细胞的鉴定方法.doc

《死活细胞的鉴定方法.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、活细胞的鉴定在生物学和医学上具有很重要的意义。细胞培养过程中耍随时记录细胞的生长情况，需要经常测定细胞的存活率；在肿瘤细胞的研究屮，为了检验各种药物对肿瘤细胞的杀伤力，也需要测定肿瘤细胞的存活率。在临床医学中死活细胞的鉴定也有很大的应用，例如为了检测某一男子的生育能力，测定精子细胞的存活力是比较常用的办法。死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。但是通过直接的形态观察来鉴别细胞死活，实验结果很容易受操作者的主观因索的影响，存在一定的误差，所以，在实际操作中也常采用一

2、些仪器来进行精确的批量检测。不同的死活细胞鉴定方法有各口不同具体的反应机理，但无论采用何种办法,都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的茅异。常用的方法包括染色法和仪器分析法。1染色法染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡Z后，细胞膜受损，通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝，又称锥蓝，是一种

3、阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。死活细胞在代谢上的差界：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色,还原型为无色。曲于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无述原能力或述原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。荧光素双醋酸酯(FDA)是一种常用的培养动植

4、物细胞以及植物细胞原牛质体的生活力鉴定染料，其染色机理也利用了死活细胞在代谢上的差异：FDA本身不产生荧光，也无极性，能自由渗透岀入完整的细胞膜。当FDA进入活细胞后,被细胞内的脂酶分解，生成有极性的、能产生荧光的物质——荧光素，该物质不能自市透过活的细胞膜，积累在细胞膜内，因而使有活力的细胞产生绿色荧光;而无活力的细胞因不能使FDA分解，而无法产生荧光。除此Z外，述有一些细胞器的专有染料。如液泡系的专冇染料中性红。屮性红是一种低毒性染料，可以使活细胞液泡着红色，而细胞质和细胞核不被着色;死细胞的液泡不被着色或浅染，染料弥散于整

5、个细胞屮，细胞核和细胞质被染成红色。冇时侯为了壇加染色效果可以将两种染料结合使用，如甲基蓝-中性红混合染色法。2仪器分析法可采用微电极技术(利用死活细胞膜两侧电位的差异)、全口动分析细胞记数仪和流式细胞仪等，可对细胞的死活进行精确的批量检测。德国TNNOVATTS产的全自动Cedex细胞存活率/细胞计数仪/细胞分析仪是世界上第一台高分辨率、高清晰度扫描(专利)细胞分析仪，具有全口动台盼蓝染色、显微CCD成象、CEDEXI作站软件，可用于制药、医学、发酵、免疫、病理、毒性测试、生物技术等学科的研究开发和工业生产过程中的细胞计数和分

6、析。自动分析结果，检测分析数据输出(11项)：总细胞数口，总细胞浓度(cells/mL)；活细胞数目，活细胞浓度(cells/mL)；死细胞数目，死细胞浓度(cclls/mL)；细胞存活率(%)；细胞的平均圆度(compactness)；细胞的平均直径(um)；细胞团比例(AggregateRate)；细胞直径分布图(DiameterHistogram)；细胞团分布图(AggregateHistogram)；细胞圆度分布图(CompactnessHistogram)；细胞生长时间曲线(CultivationTimeChart)。

7、流式细胞仪法用来判断细胞死活的常用荧光探针有二大类：一类是能透过活的细胞膜进入细胞内而发出荧光的物质，例如FDA可被活细胞持留而发出黄绿色荧光，若细胞有损伤则会从细胞中流失，观察不到荧光。另一类是不能透过活细胞膜，但能对同定的细胞及膜冇破损的细胞的核进行染色，例如碘化丙噪(PI,Propidiumiodide)和漠化乙锭(EB,Ethidiumbromide)就是常用的第二类荧光探针。碘化丙噪(PI)不能穿透细胞膜，对于具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能染色。而对于坏死细胞，其细胞膜的完整性丧失，碘化丙噪(Pl)可以染色坏死

8、细胞。目前常用的一种细胞凋亡与坏死检测试剂盒则含有Hoechst33342和碘化丙®(PropidiumIodide,PI)两种荧光染料。细胞发生凋亡吋，染色质会固缩，Hoechst33342可以穿透细胞膜，染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。上述两种染料双