差别染色鉴定死活细胞.doc

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1、差别染色鉴定死活细胞【摘要】在生物体外培养的细胞经过一段时间培养，可通过染色鉴别细胞的死活，从而确定细胞培养的死亡率或存活率。【关键字】死活细胞染色鉴别计数【背景介绍】细胞染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作实验是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异来进行的。主要体现在：1）死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过，而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。2）死活细胞在代谢上的差异：由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，而死细胞或代谢缓慢的老细胞

2、，则因它们的无还原能力或还原能力极弱。活细胞必需通过控制物质进出细胞膜来保持内部生理环境的稳定性。细胞死后，细胞膜通透性发生改变，原先不能进入细胞的物质也能够进入细胞。常见的细胞燃料有：中性红、台盼蓝、甲基蓝、美蓝、荧光素双醋酸酯等。台盘蓝染料正常情况下被活细胞阻拦在细胞膜外，只有细胞膜受损或者细胞死亡后，才能进入细胞，从而与解体的DNA结合，使其着色，因此，活细胞一般不能被台盘蓝染色，而死细胞会被染成蓝色。通过显微镜很容易就能识别出死亡冻得被染色的细胞，并可用细胞计数板进行计数。伊红和苏木精是最常用的细胞染色剂（参见脂肪细胞染色实验）。

3、伊红在很多生物技术中都有应用。伊红有自发荧光特性。悬液中细胞的精确计数，往往采用血细胞计数器。【实验仪器及试剂】血细胞计数板、显微镜、盖玻片、试管、吸管细胞悬液、台盼蓝、伊红、Nacl溶液【实验步骤】1、将培养箱中的培养皿取出；2、先用肉眼，然后用显微镜观察培养的细胞。记录细胞悬液的颜色是浅紫色；同时和其它组的培养皿进行对比，观察培养液的颜色是否正常，同时分析原因；3、敲打培养皿，使得贴壁细胞释放出来，旋摇培养皿，使细胞充分悬浮；4、取0.5ml细胞悬液，分别加入一滴台盘蓝，或1.5ml伊红。轻轻充分混合后，室温下染色二分钟。5、在计数器

4、上盖上盖玻片。6、将细胞悬液滴在计数器两边V字形槽内。细胞悬液依毛细作用扩散到计数区。7、在镜下计数。取中间和四个角上的中等方格，计数每个方格内死活细胞的数量。【注意事项】1、当遇到位于大格线上的细胞，一般只计数大方格的上方和右方线上的细胞。2、轻轻敲打培养皿的侧壁，不要用力过大，以免破坏培养皿；3、染色过程要混合均匀，以免影响染色效果；4、在细胞计数板上滴上细胞液时，量要适当，而且位置要适当，不要过多，以免污染镜台和物镜；5、在显微镜下观察时要轻微调节视野，观察到适宜的视野进行计数统计；【实验结果】以下便是在显微镜下观察到伊红染色的细胞

5、图片：以下是用台盼蓝染色的细胞图片：此即为在一个视野中观察到的一个中格中的细胞数目，同时在观察时可以发现几乎所有的细胞都死亡，没有存活的细胞，细胞都已被染色而且由以上观察计数的实验结果可计算得：细胞浓度=（27+22+20+33+18+30）×5×104×4=3.12×105（个/ml）。【实验讨论】1、实验进行过程中，动手同时又动脑，提高自己各方面的能力；2、实验开始的培养皿中培养液的颜色，如果细胞进行代谢，则呈黄色，如果没有进行代谢，则为浅紫色，与开始时的细胞液的颜色一致；3、用细胞计数板进行计数时，操作得当，不可盲目操作，思考怎样做

6、到最好，也可以多次操作，熟悉操作技巧；【参考文献】1、蔡文琴．现代实用细胞与分子生物学实验技术[M]．北京：人民军医出版社，2003．132、《分子细胞生物学》第三版韩贻仁主编高等教育出版社；调整细胞密度：做10-1、10-2、10-3浓度梯度，准备6只装有9mL无菌水的试管诱变准备：两瓶25mL牛肉膏蛋白胨液体培养基，两瓶25mL0.9%的生理盐水（带玻璃珠），6只9mL的无菌水，5只1mL的移液管（或者5个1mL的枪头），1瓶100mL的无菌水，离心管两个，涂布棒两只，16个培养皿。