《血清蛋白电泳》PPT课件.ppt

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1、血清蛋白电泳(SerumProteinElectrophoresis)血清和血浆血清:是指离体的血液经过自然凝固而析出的液体部分.血浆:是指离体并经过抗凝的血液经过离心沉淀后的上清部分.血清中无纤维蛋白原简介人类血液中有125种以上蛋白质成分。白蛋白、脂蛋白、抗体、补体、凝血酶原和凝血因子、抗凝血因子、α1-抗胰蛋白、α1-糖蛋白、α2-巨球蛋白、转铁蛋白和其他微量蛋白等成分。历史1809年，Pehce(俄国物理学家)首先发现电泳现象1937年，Tiselius(瑞典)制成界面电泳仪，应用于蛋白质研究1948年，

2、Wieland和Fischer建立了滤纸电泳法，奠定了区带电泳技术的基础1959年，Raymond和Weintraub创建聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳和电泳技术电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。应用电泳技术除了用于小分子物质的分离分析外,最主要用于蛋白质,核酸等生物分子的研究.由于电泳法设备简单,操作方便,具有高分辨率及选择性特点,已成为医学检验中常用的技术.COO-COO-COOH╱+H+╱+H+╱Pr←————→Pr←————→Pr╲

3、+OH-╲+OH-╲NH2NH3+NH3+PH>PIPH=PIPH

4、、吸附作用等电渗液体对固体支持物的相对移动，由缓冲液的水分子和支持介质的表面之间产生的一种相关电荷所引起。如果电渗与电泳方向相同，V变大；反之变小。血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳原理在pH8.6碱性环境，血清蛋白均带负电荷，在电场中向正极移动各种蛋白质pI不同，带电荷量有差异蛋白质的分子大小与分子形状不相同带电荷多、分子量小者，泳动较快；反之则较慢蛋白质的等电点、分子量及迁移率蛋白质名称等电点相对分子量电泳迁移率白蛋白4.846.9万5.9*10-5α1-球蛋白5.0620万5.1*10-5α2-球蛋白5.0630

5、万4.1*10-5β-球蛋白5.129万～15万2.8*10-5γ-球蛋白6.86～7.3015.6万～30万1.0*10-5电泳结果示意图γβα2α1清蛋白染色时染料与蛋白质特异结合而不与醋纤膜结合，染色深浅与蛋白质的量成正比染色一段时间后脱色，将各蛋白区带剪下，经脱色、比色即可计算出各蛋白质组分的相对百分数。如同时测定出总蛋白浓度，还可计算出各蛋白组分的绝对浓度正常血清电泳扫描图谱试剂缓冲液：巴比妥缓冲液（pH8.6）染色液：丽春红S染色液漂洗液：3%（V/V）醋酸溶液洗脱液：0.1mol/LNaOH溶液操作

6、准备电泳槽准备CAM的准备点样吸3-5μl血清均匀点于CAM无光泽面电泳无光泽面朝下，点样侧置于负极端，通电染色将薄膜条浸入丽春红S染色液，染5-10min漂洗醋纤膜规格及点样示意图定量取试管6支，在白蛋白管内加入0.1mol/LNaOH液6ml，其余各管加入3ml，将各蛋白区带剪下分别置于各试管中，另从空白背景剪一块平均大小的膜条置于空白管中，37℃10-20min向白蛋白管中加入40%醋酸0.6ml,其余各管加0.3ml,以中和部分NaOH用520nm比色，以空白管调零，读各管吸光度计算设各部吸光度分别为AA

7、、Aa1、Aa2、Aβ、Aγ。吸光度总和（AT）为：AT=AA+Aa1+Aa2+Aβ+Aγ白蛋白（%）＝（AA*2AT）*100%a1-球蛋白（%）=（Aa1AT）*100%……注意事项通电时，不得接触槽内缓冲液或CAM，以防触电缓冲液液面要保证一定高度标本：血清应新鲜，不得溶血染料：对蛋白质的各组分亲和力相同，水溶性好，稳定，吸光度敏感，形成的染料蛋白质复合物稳定且易洗脱比色注意事项电泳后区带拖尾、各区带分开不明显原因：点样过多点样不均匀、不整齐样品触及薄膜边缘；薄膜过湿，样品扩散；薄膜未完全浸透或温度过高导致

8、干燥或水分蒸发薄膜与滤纸桥接触不良薄膜位置歪斜、弯曲，与电流方向不平行缓冲液变质；样品不新鲜CAM质量不高等电渗现象评价优点：CAM电泳具有灵敏度高，标本用量少，分辨率高，区带清晰，电泳时间短，操作简便快捷；CAM对染料不吸附，蛋白区带均匀，背景清晰，既易比色定量，又易透明后进行光密度扫描。缺点：有轻微电渗现象，薄膜吸水性差，电阻容易增大，当电流较大时，薄膜中水分极易蒸发