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《谈从蛋白质自组装的角度探析甘草附子配伍减毒机制.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、谈从蛋白质自组装的角度探析甘草附子配伍减毒机制附子是毛良科植物乌头子根的加工品，味辛、甘，大热、有毒，附子的主要药效成分和毒性成分为乌头碱(aconitine,AC)o在临床应用中,甘草与附子常配伍使用，其中的经典方剂当属四逆汤，近年来多项相关研究结果表明,甘草附子配伍能降低附子的毒性或附子有毒成分的含量，且随着甘草用量的增加，附子的毒性会相应减弱。甘草能解附子之毒的观点己被大多数人所认识，亦有很多实验证明了此观点。但对于甘草中何种成分解毒,具体的解毒机制、环节却众说纷纭。近年来，蛋白质自组装现象引起了不同领域研究者的广泛关注。在临床医学上，蛋白自组装形成的纤
2、维状聚集体与多种神经退行病变的表现紧密相关，其中包括帕金森、阿尔茨海默氏症和疯牛病。在食品领域,乳清蛋白、酪蛋白和大豆蛋白的热诱导自组装也获得了广泛的关注，它们不仅对食品性状的改良有重要意义，对营养成分的递送也具有重大潜力。在药物递送载体领域，蛋白质自组装研究也显示了其特殊的重要意义。玉米蛋白(zein)是一种〃一般认为安全〃(generallyrecognizedassafe,GRAS)的食品级原料，以它自组装形成的纳米药物递送体系将极大地降低对纳米材料生物毒性的担心。中药汤剂体系具备了蛋白质自组装的几个必要条件,如热诱导；许多重要的药材都具有极高的蛋白质含
3、量；从药材干制、炮制到煎煮的过程中，美拉德反应贯穿其中，许多蛋白质特性因此获得改进，更容易形成可溶性的胶体颗粒。因为在煎煮的过程中,产生了大量的胶体颗粒,中药汤剂最终形成的实际上是一个包含真溶液、胶体、悬浊液等的多相体系。在前期工作中，从甘草中发现了一类高含量的非酶促糖基化蛋白具有自组装为可溶性胶体颗粒的能力。本硏究利用纯化的甘草蛋白（GlycyrrhizaeRadixetRhizomaprotein,GP）构建了蛋白纳米颗粒z调查了该甘草蛋白纳米颗粒对乌头碱的结合能力，并测试了甘草蛋白-乌头碱颗粒的动物体内毒性，尝试从蛋白质自组装的角度对甘草可以降低附子毒性
4、的现象进行探究。1材料与方法1.1材料本实验所采用的药材均购自北京双桥燕京中药饮片厂，甘草饮片（批号1406004）经福州市药品检验所根据《中国药典》2010年版一部甘草质量标准鉴定合格。附子（批号1406004）经福州市药品检验所根据《中国药典》2010年版一部附子质量标准鉴定合格。乌头碱对照品（批号20130525,HPLC纯度98.5%）来自于福建省药品监督管理局。1.2药材煎液的制备将准确称量的30g药材于150mL去离子水中充分浸泡30min后，加热至沸腾，计时煎煮30mino将所得煎液经3层纱布过滤，滤过液以12000xg,25°C离心15mino
5、将所得上清液以去离子水定容至150mL备用。1.3甘草蛋白纯化将200g甘草饮片用胶体磨研磨成粒径约为80目的粉末与0.02mol丄-1的磷酸缓冲液(pH7.2z0.1mol丄-1NaCI)以质量比1:5混合后,于4°C下浸提12ho将所得抽提液用10mol丄-1NaOH调节pH9.8~10.0静置10min后，离心去除溶液中的甘草酸。所得上清液先后经过40%乙醇和60%乙醇分级沉降后获得甘草蛋白粗提液。通过离子交换和疏水色谱两步法可以纯化出相对分子质量为31.0kDa的目的蛋白GP。1.3.1离子交换色谱条件Macro-PrepHigh-Q离子交换色谱柱,0
6、.02mol-L-1zpH8Tris■盐酸缓冲液平衡，0~0.5molL-1NaCI的线性梯度洗脱200mL,后用含0.5mol-L-1NaCI的T「is-盐酸缓冲液(0.02molt-1,pH8.0)等度洗脱，流速1mLmin-lo柱体积10mmx250mmo检测波长280nmo1.3.2疏水色谱条件POROS@R1疏水色谱柱,—级水平衡,流动相一级水(A)■乙瞰B);梯度洗脱，0~100%B;流速1.0mL-min-1；进样量5mL;检测波长280nmo1.4甘草蛋白(GP)纳米颗粒和甘草蛋白-乌头碱(GP-AC)纳米颗粒的制备将2.0mL纯化所得甘草蛋白
7、(0.46g-L-1)以1mo"・1的HCI调节样品至pH5.0后，于室温静置10min0以马尔文粒度仪(Nano-ZS90)和TSKgelG6000PW凝胶色谱观测颗粒形成情况，色谱条件：柱体积7.8mmx30cm，流动相0.02mol-L-1磷酸缓冲液(pH7.2)，流速0.5mL-min-1,检测波长280nmo取1.990mL甘草蛋白溶液(0.46g丄・1)与0.01mL溶于甲醇中的乌头碱溶液（20g・L・1）混合均匀后，用1moM・1的HCI调节样品至pH5.0后，于室温静置10min。颗粒形成情况同样通过马尔文粒度仪和凝胶色谱观测。1.5甘草蛋白的
8、SDS-PAGE电泳参照文献方法进行电
