内毒素检测影响因素.doc

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1、关于细菌内毒素检查法中几个问题的探索本文是通过与客户的交流以及客户咨询的相关问题，进行一次归纳总结。通过工作中出现的问题有必要对以下三种情况进行交流，以加强对细菌内毒素检查法的正确理解，同时纠正一些错误的观念。·如何全面理解细菌内毒素检查法中污染物对试验结果的影响？·如何正确认识器皿洗涤的重要性？·如何正确理解鲎试剂的抗干扰能力和鲎试剂的特异性？许多客户对污染的认识是不全面或错误的，他们认为在细菌内毒素检查过程中，器皿被污染的结果必然导致阳性结果的出现，但试验结果正好与他们的认识有时正好相反，可能阳性对照全

2、为阴性，对此亦有百思不得其解。要正确理解这个问题，首先要正确理解鲎试剂与内毒素的反应机理，鲎试剂与内毒素的反应为一系列酶反应，生物酶反应受许多因素的干扰。在日常工作中，我们要特别注意一些因素对试验结果的影响，如PH值、器皿的洁净度以及环境因素等。图1  鲎试剂与内毒素的反应机理1、pH值：鲎试剂生物活性在pH6-8时酶活性稳定；pH≤3或≥10时，酶活性受到抑制。故鲎试验时，供试品pH最好应预调和6.8-8.0为好，必要时可用无内毒素的HCl或NaOH稀溶液调节pH值。2、器皿：内毒素稀释不宜用注射器，而应

3、用经过校正的刻度玻璃吸管。因为注射器刻度准确度差，而且针栓壁磨沙面易吸附内毒素，试验误差大。同时要特别注意注射器针头引入的铁离子对试验结果的干扰，铁离子对鲎试验反应有较强的抑制作用。操作中常用的聚丙烯塑料管可能干扰试验结果，故宜慎用。3、金属阳离子：离子对细菌内毒素测定结果影响较大，一方面阳离子如Fe3+、Al3+强度较大会引起内毒素的聚集造成内毒素局部浓度过高，同时还必须注意高价阳离子（如Fe3+）对鲎试剂酶反应具有强抑制作用；另一方面鲎试剂必须在二价阳离子Ca2+、Mg2+的参与下才能被激活形成凝胶反应

4、。许多药物因PH值≥10时，其中的阴离子会吸收鲎试剂中的Ca2+、Mg2+离子，使实验呈假阴性。4、其它物质：如血液中的凝血因子、络合剂、抗凝剂等，都可能干扰鲎试剂与内毒素的反应，同时消毒剂和有机溶剂对鲎试验都有抑制作用。一、器皿洗涤的重要性《中国生物制品操作规程》389页——细菌内毒素检查法“玻璃器皿的洗涤”规定：“ 将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并烘干水分后，置洗液中浸泡4小时，取出将洗液沥干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥（禁用超纯水或久置的蒸馏水冲洗）后置适宜的密闭金属容器

5、中，迅速置烤箱中，除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素。”应该特别注意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器皿必须“用新鲜蒸馏水冲洗，禁用纯化水和久置的蒸馏水冲洗。”有的客户使用反渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃器皿，结果试验中所有的阳性对照都为阴性，复核鲎试剂灵敏度时试验结果误差较大，这主要是由于纯化水和蒸馏水的内在质量不同所造成的。因纯化水中存在的阴阳离子经250℃高温干烤不能完全被破坏，这时不同的离子就产生对鲎试剂酶反应抑制或增强的反应，为了保证试验结果的准确性和检验报告的权威性，我们应该严格遵守操作规程，用

6、新鲜多效蒸馏水冲洗鲎试验用玻璃器皿。二、抗干扰能力和鲎试剂的特异性有客户在做白蛋白的干扰试验时使用两个厂家的鲎试剂，干扰试验结果其中一个厂家的鲎试剂需要稀释4倍而另一个厂家的鲎试剂需要稀释8倍才能排除干扰。据此向我们咨询是否稀释倍数小的鲎试剂抗干扰能力强？而稀释倍数大的鲎试剂抗干扰能力就差？我们认为对一些粘度较大的产品白蛋白、医用透明质酸钠，建议使用8倍或16倍稀释来建立内毒素常规检查规程（SOP），因为鲎试验是一种复杂的酶反应，任何一种药品、生物制品的浓度或粘度对试验结果皆有影响，是抑制还是增强反应仍需做

7、具体的分析。单纯以干扰试验的稀释倍数来判断鲎试剂的质量是片面的。如何判断鲎试剂抗干扰能力，必须从几个方面进行分析：1、 鲎试剂灵敏度的差异 不同厂家的鲎试剂虽然标示值（λ）相同，但仍然存在较大的误差。比如，标示值为0.5EU/ml的鲎试剂，若有的产品真实灵敏度可能是0.75EU/ml或1.0EU/ml；而另一个厂家的鲎试剂可能是0.35EU/ml或0.25EU/ml时，按0.5-2λ误差标准都是合格产品，但对同一检品虽然在相同的稀释倍数下，这两个厂家的鲎试剂产品对内毒素的检出水平却不同。2、鲎试剂与内毒素脂

8、多糖反应的差异 在正常的药品、生物制品生产时，因不同时期的原料来源和水源的因素，都可能导致半成品或成品污染的菌株不同，而导致内毒素脂多糖物质与鲎试剂反应的活性不同。有的鲎试剂对革兰氏阴性菌或各种微生物产生的内毒素脂多糖均有敏感性，有的鲎试剂可能只对革兰氏阴性菌产生的内毒素敏感而对其它微生物产生的内毒素脂多糖不敏感，故同一检品虽然在相同稀释倍数下，两个厂家的鲎试剂对内毒素的检出能力亦不同。3、pH值的影响 鲎试剂生