基因工程抗体.ppt.ppt

《基因工程抗体.ppt.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、抗体研究进展3个阶段：①1890年白喉抗毒素，多克隆抗体；②1975年杂交瘤技术单克隆抗体；③1994年基因工程抗体；第四节基因工程抗体与噬菌体抗体库融合蛋白一、噬菌体抗体库技术的基本方法⒈获取目的基因⒉抗体库技术的载体⒊淘筛⒋鉴定与表达一般都是从RNA经反转录PCR获得抗体某一特定基因区段比如：轻链和重链可变区（VH和VL）噬菌粒（具有噬菌体和质粒特点）最多的ｐHEN1：抗体蛋白和噬菌体外壳蛋白以融合蛋白形式存在载体表面；基因序列中含有琥珀终止码，可被抑制基因SupE抑制而翻译成谷氨酸经抗原固定化后，对噬菌粒群进

2、行吸附、洗涤、洗脱、再感染、再抗原固定吸附、洗涤、洗脱，反复进行目的克隆DNA导入感受态菌株，进行可溶性表达，其产物用Westernblot分析确定二、噬菌体抗体库技术的特点⒈模拟天然全套抗体库⒉避开了人工免疫和杂交瘤技术⒊可获得高亲和力的人源化抗体抗体文库可达１０１１库容，能包含B细胞全部克隆目的基因来自人体外周血、骨髓、脾脏的淋巴细胞中的总ｍRNA，得抗体可变基因；引物采自多个人体；抗体可变基因随机重组抗体库大容量可以调出任意抗体基因，用基因工程方法制备抗体抗体可变基因随机重组模拟了人体内亲和力成熟过程，基因来

3、自于人噬菌体抗体库技术的特点三、基因工程抗体表达第五节抗体诊断试剂３大抗体药物：血清学鉴定用的抗体类试剂；免疫标记技术用用的抗体类试剂；体内导向药物。试剂：体外试验用的，可发生某种反应药物：体内导向诊断用的，可发生某种反应一、血清学鉴定用的抗体类试剂指用已知抗体来鉴定未知的抗原型，主　　　要用于疾病的病原菌的诊断和血型鉴定方法：凝集反应应用：鉴定病原菌乙型肝炎病毒测定妊娠诊断ABO血型系统检查⒈鉴定病原菌的血清抗体试剂⑴常用诊断血清的品种和用途常用3类：①沙门氏菌属诊断血清②志贺氏菌属诊断血清③病原性大肠埃希氏菌诊

4、断血清⑵诊断血清的制备步骤①制备细菌抗原②免疫动物和制备抗体血清O抗原：接种细菌于琼脂培养基；培养收集菌苔；用生理盐水制成菌液；(破坏鞭毛抗原)１00℃水中煮沸2.5ｈ或加入甲醛溶液杀菌H抗原：接种细菌于琼脂培养基；培养收集菌苔；用生理盐水制成菌液；加入甲醛溶液杀菌将含抗原液体适当稀释，通过静脉、腹腔、皮下等途径，接种于兔、马、羊、鼠体内，接种次数为3－7次，每次间隔3－4d，最后采血⑶诊断血清诊断方法方法：凝集反应⒉乙型肝炎病毒表面抗原的反向被动血凝诊断试剂反向被动血凝试验：用纯化的抗体致敏醛化血细胞测定抗原试剂

5、制备原理：红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能吸附蛋白，当纯化的抗乙型肝炎病毒的血清吸附其上时便具有抗体活性，若待测样品中存在有HBsAg时，则发生特异性结合而使血红细胞发生凝集。细菌、红细胞等颗粒性抗原中加入相应抗体后，在有适量的电解质存在下，能形成肉眼可见凝集块试剂制备步骤：用乙型肝炎病毒抗原免疫鼠获得抗乙型肝炎病毒的血清经硫酸铵盐析和DEAE-Sephadex柱层析得IgG人红细胞用丙酮和甲醛处理加入pH4.0磷酸缓冲液洗去多余蛋白加入⒊妊娠诊断试剂⒋抗ABO血型系统血清ABO血型抗血清的制备：可以用人的血、用

6、人血型物质A、B动物免疫动物、单克隆抗体1）人源性ABO血型抗血清采集健康献血者的血，凝固后置4℃冰箱中过夜，将杂质抗体和血块一起除去，然后分离血清，56℃30min使补体活性丧失，如果此血清中含有B抗体（抗B血清）2）动物源性ABO血型抗血清用人血型物质A抗原和B抗原，免疫马而得到的抗体血清；人的血型物质人的红细胞或唾液，免疫成功后用人O型红细胞吸收掉非特异性抗体，除菌过滤方法：玻片直接凝集反应3）单克隆抗体是应用B淋巴细胞杂交瘤技术生产抗A或B血清二、免疫标记技术用的抗体类试剂⒈荧光抗体诊断试剂⒉免疫酶抗体诊断

7、试剂⒊放射免疫用抗体诊断试剂⒈荧光抗体诊断试剂⑴荧光抗体的制备是用荧光色素（异硫氰酸、罗丹明、藻红素等）标记抗体，成为荧光抗体，荧光抗体与微量抗原结合后在营光显微镜下成为发光可见物用碳酸缓冲溶液(CB)将抗体溶液浓度调为20mg/ml用CB将荧光色素调为0.2mg/ml电磁搅拌，缓慢滴入流水、磷酸缓冲盐水透析SephadexG25吸附用碳酸钙调pH，使溶液pH在9.0-9.54℃下搅拌6－12h洗脱液⑵免疫荧光测定方法直接法间接法采用荧光抗体直接与抗原反应，用于抗原鉴定、定位、分布采用荧光标记抗球蛋白抗体（荧光第二

8、抗体）来检测未知抗原检测时，只用未标记的相应抗体处理标本，充分洗涤后，再加荧光第二抗体，再洗涤，只荧光显微镜下观察，如见到荧光，表明有抗体抗原复合物存在⒉免疫酶抗体诊断试剂⑴免疫酶染色法⑵酶免疫测定与荧光抗体原理相似，其差异是该法用酶标记抗体当酶标记抗体与抗原结合后，加入适当的酶底物，底物在酶催化下发生反应，产生有色物，在光学显微镜下可见常用：酶－辣根过氧化