免疫学 第7章 抗原抗体反应及应用.ppt

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1、第七章抗原抗体反应及应用教学目标和要求：掌握不同抗体的制备的原理与程序；掌握抗原抗体反应的原理；熟悉常见免疫分析方法。教学重点和难点：不同抗体的制备的原理与程序以及抗原抗体反应的原理。主要内容第一节抗体的制备第二节抗原抗体反应原理第三节常见免疫分析方法第一节抗体的制备一、基本概念二、抗血清的制备三、单克隆抗体的制备四、基因工程抗体的制备一、基本概念1.多克隆抗体p140：由多个抗原决定簇刺激不同B细胞克隆而产生的抗体。如：抗血清。2.单克隆抗体p140：由一个B细胞克隆所分泌的针对一个抗原决定簇的抗体。3.基因工程抗体：又称重组抗

2、体，是指利用重组DNA和蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配，经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子。4.催化性抗体(抗体酶)p148：具有催化活性的抗体。二、抗血清的制备(一)免疫动物4.免疫途径的选择免疫动物的途径：动物种类、抗原特性、是否使用佐剂腹腔注射、肌内注射、皮内注射、皮下注射：任何抗原静脉注射：可溶性抗原及分散的单细胞悬液，不能使用佐剂脾脏直接注射、体外免疫：单克隆抗体二、抗血清的制备初次免疫后要经过2-3次以上的免疫加强，两次免疫注射之间的间隔一般为2－4周，小动物可间隔10－14天，大动物

3、2个月左右。二、抗血清的制备(二)抗血清的纯化与保存纯化：盐析法：蛋白质分子越大，沉淀时所需盐离子浓度越低色谱法:更高纯度保存：低温、冷冻干燥二、抗血清的制备(三)抗血清的特性鉴定p1421.效价(滴度)：显示抗血清中特异性抗体相对含量的一个半定量指标，在给定的条件下，结合一定量抗原的抗血清的稀释度。2.亲和力（K）：抗血清与相应抗原的结合强度3.抗体特异性与交叉反应三、单克隆抗体的制备(一)基本原理杂交瘤技术（hybridomatechnique）即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。克勒（Kohler）和米尔斯坦（Mils

4、tein）（1975）证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体。这一技术的基础是细胞融合技术。骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合，则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，融合的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。两种细胞骨髓瘤细胞特征：在培养条件下无限分裂、增殖；次黄嘌呤-

5、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺失脾淋巴细胞(经抗原免疫)特征：分泌抗体功能和能够在选择培养基上生长融合后，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆(二)单抗制备流程1.抗原免疫选择抗原动物选择免疫途径选择抗原颗粒性抗原：细胞、细菌和病毒等，颗粒性抗原一般具有良好的免疫原性，可直接免疫动物。可溶性抗原：如蛋白质、碳水化合物或核酸，多肽，可和福氏完全佐剂混合，制成乳剂后免疫动物。动物选择常用:六周龄的雌性Balb/c小鼠免疫途径选择皮下注射腹腔注射静脉注射肌肉注射脾脏直接注射皮下免疫腹腔注射尾静脉免疫足垫免疫脾

6、脏免疫－1所需器具称重脾脏免疫－2注射麻药脾脏免疫－3打结固定小鼠脾脏免疫－4酒精消毒去毛碘酒消毒脾脏免疫－5剪开外皮剪开腹膜找到脾脏脾脏免疫－6注射抗原缝合伤口每隔15天重复注射作加强免疫，共重复2次第三次免疫之后10天，将小鼠断尾取血，用ELISA方法，检测血清效价。取脾细胞融合前3天加强免疫一次，以活化B淋巴细胞2.脾细胞和骨髓瘤细胞的准备脾细胞的制备：将Balb/c小鼠处死。浸泡在75％乙醇中带入无菌室。取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；在脾脏下侧提起腹膜，

7、剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入盛有5mlHanks液的培养皿中；A：梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；B：钢网研磨法：将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，用注射器针芯轻轻研压脾脏，获细胞悬液；C：酶消化法：将脾脏用镊子夹碎，加入400u/ml胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。2.脾细胞和骨髓瘤细胞的准备骨髓瘤细胞的

8、准备选择生长旺盛，形态良好的细胞将上清倒入离心管内，剩余贴壁的细胞用0.02％EDTA消化液消化细胞5分钟后倒入同一离心管，1000～1500rpm离心5分钟，收集细胞计数骨髓瘤细胞消化数分钟中止消化、吹散细胞收集细胞、离心计数骨髓瘤细胞系的选择要