第07章抗原抗体反应及应用ppt课件.ppt

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1、第七章抗原抗体反应及应用本章提要抗体的制备与应用抗血清的制备单克隆抗体的制备基因工程抗体催化性抗体单抗的医学应用抗原抗体反应抗原抗体反应原理抗原抗体反应特点常见免疫分析方法沉淀反应凝集反应免疫标记技术补体参与的抗原抗体反应免疫分析灵敏度本章小结课后思考题7.1.1抗血清的制备抗原的准备免疫动物动物的选择免疫途径免疫剂量与周期动物采血法抗血清的纯化与保存抗血清的鉴定抗血清与多克隆抗体抗血清(antiserum)：用抗原人工免疫实验动物，可获得含有特异性抗体的血清，称为抗血清。多克隆抗体(polyclonalantibody)：抗血清中抗体是多个抗原决定簇刺激不同

2、B细胞产生的抗体，所以称为多克隆抗体。抗原的准备半抗原与载体偶联制备完全抗原常用的连接反应及双功能连接剂佐剂的使用：佐剂与抗原按1：1比例混合乳化动物的选择抗原与免疫动物的种属差异越远越好。对蛋白质抗原，大部分动物皆适合常用的是山羊和家兔；甾体激素免疫多用家兔；酶类免疫多用豚鼠。抗血清量的需要：大动物如马、骡等可获得大量血清（一头成年马反复采血可获得10000ml以上的抗血清）；但有时抗体需要是不多，选用家兔或豚鼠即可。免疫途径一般采用多点注射，一只动物注射总数约为8~10点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背部两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，免疫效果较好；亦有肌肉

3、、腹腔、静脉注射途径。腹腔、肌肉、皮内、皮下注射适合使用任何抗原，刺激局部淋巴结发生免疫应答；静脉注射适合可溶性抗原及分散的单细胞悬液，不使用佐剂，免疫应答主要发生在脾脏。免疫剂量与周期免疫剂量：抗原用量视抗原种类及动物而异，一般大动物抗原剂量（以蛋白抗原为准）约0.5~1mg/只，小动物约0.1~0.6mg/只。免疫周期：初次免疫后，再经2～3次以上的加强免疫，一般3～4周间隔适合大部分动物，小动物10～14天，大动物2月左右。动物采血法颈动脉放血法：这是最常用的方法，对家兔、山羊等动物皆可采用。心脏采血法：此法多用于豚鼠、大鼠、鸡等小动物。此法采血技术应熟

4、练，穿刺不准容易导致动物急性死亡。静脉多次采血法：家兔可用耳中央静脉，山羊可用颈静脉。这种放血法可隔日一次，有时可采集多量血液。抗血清的纯化与保存试血、采血：加强免疫后2－3次，可通过耳静脉或眼球采血，进行抗血清效价测定，当效价达到理想高度，可以心脏直接采血或动脉放血。待血凝后用针筒或吸管吸取血清。抗血清纯化：盐析、层析(离子交换、分子筛、亲和层析)。保存：低温冻存，冻干、加保护剂（叠氮化钠NaN3或BSA）4℃保存。抗血清的鉴定效价鉴定：效价又称滴度（titer），是表达抗血清中特异性抗体相对含量的一个半定量指标，即在一定条件下结合一定量抗原的抗血清的稀释度

5、。亲和力鉴定：亲和力（affinity）指抗血清与相应抗原结合的强度，是描述抗体特异性的重要指标，常用亲和常数K表示。抗体特异性鉴定：常用琼脂双扩散法鉴定抗体特异性。7.1.2单克隆抗体的制备单克隆抗体（monoclonalantibody，MAb）——由单一B细胞克隆合成并分泌的一种组成均一的免疫球蛋白分子，简称单抗。单抗制备的原理单抗制备的材料单抗制备的技术单抗制备流程图单抗制备的原理MAb是单一B细胞克隆产生的，其特异性是针对一个抗原决定簇的，它是B细胞克隆的标志。为使B细胞在体外能长期存活，Kǒhler和Milstein于1975年创建了杂交瘤方法。其

6、基本原理是：将分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能长期体外培养但不能分泌抗体的瘤细胞融合，筛选出既能分泌抗体又能长期体外培养的杂交瘤细胞，然后单克隆化，并扩大培养，从而进行单抗生产。单抗制备的材料骨髓瘤细胞：不产生抗体或产生抗体的某种链但不分泌次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷型B细胞——小鼠或大鼠脾脏融合剂——50%的聚乙二醇（PEG）或电脉冲HAT选择培养基——含10%-20%小牛血清和HAT的RPMI1640）单抗制备的技术抗原提纯与动物免疫骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备细胞融合HAT法筛选杂交瘤细胞阳性细胞的筛选、单克隆化与

7、保存单克隆抗体的制备与纯化抗原提纯与动物免疫抗原纯度越高越好，尤其是初次免疫抗原。选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c（巴比塞）健康小鼠，鼠龄在8~12周，雌雄不限，可同时免疫3~4只小鼠。免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得高效价抗体为最终目的，免疫间隔一般2~3周。末次免疫后3~4天，取出脾脏组织，制成单细胞悬液。骨髓瘤细胞与饲养细胞的制备选择瘤细胞株应用最多的是源自BALB/c小鼠的Sp2/0骨髓瘤细胞株，要求是次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）缺陷型（HGPRT-，TK-）。

8、融合时应选择处于对数生长期、细胞形态和