核酸提取原理及方法ppt课件.ppt

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1、核酸提取原理及方法1前言核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此，核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。2主要内容核酸简介基因组DNA提取质粒DNA提取真核细胞总RNA提取琼脂糖凝胶电泳3核酸简介核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两类。DNA主要储存遗传信息。RNA主要传递遗传信息。4核酸简介如何分离RNA？如何分离DNA？5核酸简介——质粒DNA质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭

2、环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌等细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。6核酸简介基因组DNA提取质粒DNA提取真核细胞总RNA提取7基因组DNA提取方法基因组DNA提取的几种常用方法：CTAB法SDS法其他方法8基因组DNA提取——CTAB法CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/LN

3、aCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。9基因组DNA提取——CTAB法CTAB提取缓冲液的经典配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巯基乙醇终浓度100mM20mM0.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成

4、醌，避免褐变，使酚容易去除。10基因组DNA提取——CTAB法CTAB提取缓冲液的改进配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巯基乙醇终浓度100mM20mM0.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。11CTAB法实验流程基因组DNA提取——CTAB法植物材料抽提核酸沉淀液氮研磨上层溶液细胞裂解DNA溶液干燥溶解离心洗涤12SDS法原理SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（

5、55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。基因组DNA提取——SDS法注：SDS法适用于大部分实验材料基因组DNA提取。如动物组织、细胞、全血、细菌、酵母等。13SDS提取缓冲液的配方基因组DNA提取——SDS法组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS终浓度50mM20mM0.4M2%Tris-HCl（pH8.0）：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA：螯合

6、Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl：提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中。14基因组DNA提取——SDS法SDS法实验流程（以动物组织为例）动物组织抽提酒精沉淀液氮研磨或匀浆上层溶液细胞裂解DNA溶液干燥溶解离心洗涤15基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测小鼠gDNA电泳图琼脂糖凝胶电泳：以琼脂糖凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。16基因组DNA提取常见问题DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应DNA降解DNA量少17基因组DNA提取常见问题分析DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应DNA中含有蛋

7、白、多糖、多酚类物质——抽提纯化、高盐洗涤DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应——重新沉淀DNA中残留有金属离子——重新70%乙醇漂洗18基因组DNA提取常见问题分析DNA降解材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染19DNA提取量少实验材料不佳或量少——选取新鲜（幼嫩）材料破壁或裂解不充分——充分研磨、破壁酶、延长裂解时间沉淀不完全——低温、延长沉淀时间洗涤使得丢失DNA基因组DNA提取常见问题分析20核酸简介基因组DNA提取质粒D