核酸提取原理及方法

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1、赢润生物曾林核酸提取原理及方法前言核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此，核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。http://www.yrbio.com主要内容核酸简介基因组DNA提取质粒DNA提取真核细胞总RNA提取琼脂糖凝胶电泳http://www.yrbio.com核酸简介核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两类。DNA主要储存遗传信息。RNA主要传递遗传信息。http://www.yrbio.com核酸简介如何分离RNA？如何分离DNA？

2、http://www.yrbio.com核酸简介——质粒DNA质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌等细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。http://www.yrbio.com核酸简介基因组DNA提取质粒DNA提取真核细胞总RNA提取http://www.yrbio.com基因组DNA提取方法基因组DNA提取的几种常用方法：CTAB法SDS法其他方法http://www.yrbio.com基因组DNA提取

3、——CTAB法CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。http://www.yrbio.com基因组DNA提取——CTAB法CTAB提取缓冲液的经典配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巯基乙醇终浓度100mM20mM0.4M2%(W/V)0.1%（V/V）

4、使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。http://www.yrbio.com基因组DNA提取——CTAB法CTAB提取缓冲液的改进配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巯基乙醇终浓度100mM20mM0.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙

5、烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。http://www.yrbio.comCTAB法实验流程基因组DNA提取——CTAB法植物材料抽提核酸沉淀液氮研磨上层溶液细胞裂解DNA溶液干燥溶解离心洗涤http://www.yrbio.comSDS法原理SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的

6、DNA。基因组DNA提取——SDS法注：SDS法适用于大部分实验材料基因组DNA提取。如动物组织、细胞、全血、细菌、酵母等。http://www.yrbio.comSDS提取缓冲液的配方基因组DNA提取——SDS法组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS终浓度50mM20mM0.4M2%Tris-HCl（pH8.0）：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA：螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl：提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中。http://www.yrbio.com基因组DNA提取——SDS法SDS法实验流程（以动物

7、组织为例）动物组织抽提酒精沉淀液氮研磨或匀浆上层溶液细胞裂解DNA溶液干燥溶解离心洗涤http://www.yrbio.com基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测小鼠gDNA电泳图琼脂糖凝胶电泳：以琼脂糖凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。http://www.yrbio.com基因组DNA提取常见问题DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应DNA降解DNA量少http://www.yrb