核酸的提取教学ppt课件

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1、第一部分：DNA提取方法简介第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策教学内容第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见问题、原因分析及其对策第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策核酸是1869年米歇尔(F.Miescher)在脓液白细胞中发现的，他当时称之为核素。阿尔特曼(R.Altmann)于1889年认识其酸性后，定名为核酸。核酸分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两大类。核酸的发现核酸(nucleicacid)是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。是遗传信息的载体，是最重要的生物信息

2、分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。核酸的分类及分布90%以上分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体，叶绿体，质粒等。分布于胞核、胞液。(deoxyribonucleicacid,DNA)(ribonucleicacid,RNA)脱氧核糖核酸核糖核酸携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。参与细胞内DNA遗传信息的表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。核酸的理化性质晶形DNA为白色纤维状固体RNA为白色粉末状固体两性解离呈酸性在中性溶液中带负电荷溶解性均溶于水不溶于一般有机溶剂,在

3、70%乙醇中形成沉淀0.14MNaCl1~2MNaClDNA-蛋白溶解度低溶解度高RNA-蛋白溶解度高溶解度低粘度DNA粘度大(因其分子直径小而长度大)RNA粘度小核酸变性或降解后粘度降低旋光性均很强密度RNA>双链DNA；环状DNA>开环、线状DNA单链DNA>双链DNA沉降速度：RNA>环状DNA>开环、线状DNA核酸分离、纯化原则意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。分离核酸原则：温度不要太高控制pH值范围(pH值5-9)保持一定离子强度减少物理因素对核酸的机械剪切力.保持核酸分子一级

4、结构的完整性防止核酸的生物降解细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉；阴离于型表面活性剂如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂DNA酶抑制剂RNA酶（RNAase)抑制剂皂土（bentonite）：皂土

5、带负电荷，能吸附RNase，使其失活。DEPC(二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。与蛋白质中His结合使蛋白变性。使用注意：1.DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。2.容易降解，保存在4℃或液氮中；3.提RNA时，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。4.剧毒。肝素复合硅酸盐（Macaloid)RNase阻抑蛋白（RNasin）氧钒核糖核苷复合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)DNA提取的基本步骤I.材料准备II.破碎细胞或

6、包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集基因组DNA的提取质粒DNA的提取使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）细胞裂解经典的裂解液几乎都含有去污剂和盐盐的作用提

7、供一个合适的裂解环境抑制样品中的核酸酶去污剂使蛋白质变性蛋白酶裂解液裂解方法机械法化学试剂法反复冻融法酶解法确保彻底裂解样品使裂解体系中核酸浓度适中以样品中蛋白质的含量为基准裂解液的用量原则含蛋白酶的裂解方法：基因组DNA高浓度蛋白变性剂的裂解方法：RNA含CTAB的裂解法：富含多糖的样品的基因组DNA含SDS碱裂解法：质粒DNA裂解方法评价细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料－－液氮研磨动物组织－－匀浆或液氮研磨组培细胞－－蛋白酶K细菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时

8、轻柔振荡螯合剂基因组DNA的提取质粒DNA的提取菌体