肠球菌氟苯尼考耐药相关基因的检测.ppt

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1、肠球菌氟苯尼考耐药相关基因的检测杨文哲2008届药物制剂2班前言材料与方法结果分析与讨论参考文献前言20世纪80年代以来，肠球菌严重感染的发生率和病死率明显升高，并且由于肠球菌的固有耐药和获得性耐药，使许多常用抗菌药物在治疗肠球菌感染时失败。氟苯尼考耐药肠球菌的出现引起了越来越多专家的关注，其相关耐药基因fexA,fexB,cfr。本次试验是通过检测这些耐药基因，为研究氟苯尼考耐药肠球菌的流行病学特征提供依据。肠球菌为圆形或椭圆形、呈链状排列的革兰阳性球菌，无芽胞鞭毛，为需氧或兼性厌氧菌。材料与方法（1）菌株

2、：29株肠球菌样品(牧医工程学院实验室分离保存)。试剂：氟苯尼考、麦康凯培养基、琼脂糖脑心浸出液肉汤（BHI）细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）等。仪器：稳压稳流电泳仪（DYY-4型）PCR扩增仪（2720型）紫外可见透射反射仪（WFH-201BJ型）凝胶成像仪（AlphaImagerEC型）立式压力蒸汽灭菌器（LS-B35L-I型）等。材料与方法（2）方法步骤菌株鉴定耐药菌株筛选基因组DNA提取耐药基因检测菌株分离菌株分离琼脂平板细菌划线法融化培养基：麦康凯培养基放入立式压力蒸汽灭菌器中融化并灭菌。倒平

3、板：待培养基冷却至50℃左右，按无菌操作法倒平板(每皿约15m1)，平置，待凝固。分区划线：在皿底将整个平板划分成四个面积不等的区域。各区之间的交角应为120℃左右。菌株鉴定与耐药菌株筛选鉴定：基因FG为肠球菌菌属所特有。通过特异性引物设计，基因组DNA提取，应用PCR扩增技术和琼脂糖凝胶电泳法，证实FG阳性或阴性来达到相应的目的。筛选：配制氟苯尼考溶液1.3mg/ml，摇匀备用。在净化工作台上分装于29个BHI肉汤试管中，各16μL，接种肠球菌菌株样品，置于37℃，190r/min的摇床中过夜培养，观察是否

4、有白色沉淀生成。基因组DNA提取进行菌株鉴定的29株肠球菌样本，以及筛选出的氟苯尼考耐药肠球菌均使用细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取DNA，按照说明书严格进行操作。耐药基因检测（1）引物设计根据GenBank公布的FG，fexA，fexB，cfr基因序列，采用primerpremier5软件进行引物自动搜索，并用Oligo6.0软件进行验证，最终设计出特异性引物，送英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，见图表1。耐药基因检测（2）聚合酶链式反应反应体系20µL，模板2µL，上、下游引物各1µL，Taq预

5、混酶10µL，去离子水6µL。PCR反应条件见图表2。耐药基因检测（3）琼脂糖凝胶电泳将固态凝胶放入电泳槽中，加入TAE缓冲液至胶面以上1mm处；依次加入8µLPCR产物与2µL6×LoadingBuffer的混合物，DNAMarkerDS2000作为标准，加入5µL。电压100V，时间30min。结果观察与凝胶成像将电泳凝胶进行紫外透射观察，使用凝胶成像分析系统凝胶成像，记录结果。结果（1）鉴定结果29株样本全为FG阳性，均属于肠球菌菌属。见图表3。筛选结果29株肠球菌样本中，10株为氟苯尼考耐药肠球菌，分

6、别为N6、N7、N8、F7、F2、F5、N37、N39、N43、Z育4。结果（2）耐药基因检测结果9株为fexA,fexB双阳性，1株为fexA,fexB双阴性，10株为cfr阴性。分析与讨论(1)筛选后得到10株氟苯尼考耐药肠球菌，其分离率为38%。基因fexA与fexB在氟苯尼考耐药肠球菌中的检出率均为90%（9/10）,没有检出cfr，与试验菌株数量有一定关系。CorinnaKehrenberg报道cfr，fexA在氟苯尼考耐药葡萄球菌中的检出率为18%和55%，没有cfr,fexA,fexB在氟苯尼考

7、耐药肠球菌中的相关报道。分析与讨论（2）fexB与fexA有59.7%的平均核苷酸同源性，设计的引物特异性可能会较弱，从而导致9株肠球菌中同时显示fexA,fexB阳性；然而，CorinnaKehrenberg有关于cfr和fexA在同一个质粒上的报道，因此也有fexA与fexB在同一个质粒上的可能性。通过本次试验，再次证实了氟苯尼考耐药肠球菌中的相关基因fexA和fexB，但没有验证这些耐药基因的具体位置，需要进一步做试验。参考文献KehrenbergC,SchwarzS,JacobsenLetal.Ane

8、wmechanismforchloramphenicol,florfenicolandclindamycinresistance:methylationof23SribosomalRNAatA2503[J].Mol.Microbiol2005;57:1064-1073.KehrenbergCandSchwarzS.Florfenicol-chloramphenicolexportergenefexA