利用Cas9技术修饰兔成纤维细胞Myostatin基因靶点的选择及鉴定.pdf

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2、号:xs1291009密级:公开硕士学位论文利用Cas9技术修饰兔成纤维细胞Myostatin基因靶点的选择及鉴定研究生：柳婧指导教师：潘求真学科专业：细胞生物学研究方向：分子遗传学培养学院：生命科学技术学院中国·大庆2015.12Universitycode：10223Classifiedcode：Q28Graduatenumber：xs1291009Confidentialdegree：PublicHeilongjiangBayiAgriculturalUniversityMasterDisser

3、tationEdittingrabbitfibroblastmyostatingeneinCas9technology,targetselectionandidentificationPostgraduate：LiuJingSupervisor：PanQiuzhenMajor：CellBiologyResearchdirection：MoleculargeneticsCollege：CollegeofLifeScienceDaqingChina12,20151iJf1LJJxJf!a~ftJi!f~o

4、,~1Jti=f%=~!J)JQ~t~tt*o5&iM8"1±til.7J)tr,itJti=f/G'E113Jt1mAB~£1t*EIX:m~ttEJ

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6、WlSit12jj14-B摘要肌肉生长抑制素（Myostatin）又名生长分化因子8，属于TGF-β超家族成员之一，是肌肉生长的负调控因子。当Myostatin基因的成熟肽碱基发生突变时，它表达的产物就会丧失抑制肌肉生长的功能，或该产物的抑制功能受到影响，使肌肉得以过度发育和生长，并且还会对生长性状和生产性能造成影响。CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsequences,CRISPR)系统是一种由RNA介导的基因修饰技术

7、，可以对外源基因片段进行修饰，是由成簇、规律间隔的短回文重复序列组成。本实验以CRISPR/Cas9技术为基础，对兔子成纤维细胞Myostatin基因进行修饰，在兔Myostatin基因的外显子成熟肽部分筛选了一个打靶位点，之后将来自产脓链球菌的Cas9基因按照兔子密码子偏好性进行优化，并将其分别合成到pUC57载体中，然后将pUC57-Cas9和pUC57-gRNA按照不同的摩尔数之比转染到成纤维细胞中，这7个比例分别是10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10，将转染后的细胞提取基

8、因组，经过PCR、PCR产物杂交、T7E1酶切并计算其打靶效率。结果显示，当比例是2:1时，Myostatin基因的突变效率最高。再将比例为2:1实验组的细胞进行筛选单克隆，共挑选15株单克隆细胞，扩大培养之后，对细胞提取基因组、PCR，将PCR产物连接T载体、测序，测序结果显示有5株细胞存在碱基突变和碱基缺失，并且经过氨基酸序列比对，也有氨基酸序列的突变和移码。通过Westernblot方法检测目的蛋白结合的情况，确认在5株存在碱基突变的细胞中有2株细