DB43_T 1671-2019动物疫病病毒核酸提取 磁珠法.pdf

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1、ICS65.020.30B41DB43湖南省地方标准DB43/T1671—2019动物疫病病毒核酸提取磁珠法ExtractionofAnimalDiseaseVirusNucleicAcidMagnetic-Bead-BasedMethod2019-10-15发布2019-12-15实施湖南省市场监督管理局发布DB43/T1671—2019目次前言………………………………………………………………………………………………………Ⅱ1范围……………………………………………………………………………………………………12规范

2、性引用文件………………………………………………………………………………………13术语和定义……………………………………………………………………………………………14主要仪器设备…………………………………………………………………………………………15主要耗材与器械………………………………………………………………………………………16主要试剂………………………………………………………………………………………………17样品与样品预处理……………………………………………………………………………………18核酸提取………………

3、………………………………………………………………………………29生物安全要求…………………………………………………………………………………………2IDB43/T1671—2019前言本标准按照GB/1.1—2009给出的规则起草。本标准某些内容可能涉及专利，本标准发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由湖南省畜牧水产局提出。本标准由湖南省农业农村厅归口。本标准起草单位：湖南省动物疫病预防控制中心，长沙市动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：何世成、王昌建、陈智、林源、唐小明、谭丹、范叶、王卫国、彭志、朱春霞、汪

4、洪冰。IIDB43/T1671—2019动物疫病病毒核酸提取磁珠法1范围本标准规定了磁珠法提取动物疫病病毒核酸的技术要求。本标准适用于我省动物疫病诊断、监测中的PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡所注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T1948兽医实验室生物安全要求通则3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1磁

5、珠法在核酸提取过程中，使用胍盐等去垢剂裂解细胞、释放核酸，用磁珠在高盐、低pH的条件下特异性吸附核酸，在低盐、高pH条件下解离核酸，实现核酸提取的方法。4主要仪器设备核酸提取仪；台式1.5mL离心机；微量可调移液器[（1～10）μL、（10～100）μL、（20～200）μL、（100～1000）μL等规格]；组织研磨仪或其它研磨设备；冰箱；生物安全柜；高压灭菌锅。5主要耗材与器械与移液器匹配的各规格吸头；1.5mL或2mL离心管；96孔深孔板；磁套。6主要试剂包括裂解液、洗涤液、洗脱液、蛋白酶K溶液、磁珠悬液等，

6、或等效的磁珠法商品化试剂盒。7样品及样品预处理7.1样品类型1DB43/T1671—2019血清、抗凝血、脏器组织、O-P液、拭子样品、精液、细胞培养液等样品，样品的采集、保存与运输按照NY/T541的规定执行。7.2样品预处理不同样品类型处理方法如下：a）血清、抗凝血、拭子样品、O-P液、精液、细胞培养液等液体性样品无需进行预处理，直接用于核酸提取。b）组织样品：取1g左右组织，剪碎，进行研磨匀浆，8000r/m离心1min，上清液用于核酸提取。8核酸提取8.1根据核酸提取仪的操作程序，设置96孔深孔板的功能布局

7、，包括1列裂解孔、1列磁珠孔、2列洗涤孔、1列洗脱孔。8.2在裂解孔中加入500μL裂解液、20μL蛋白酶K、200μL样品，磁珠孔中加入600μL磁珠稀释液、25μL磁珠悬液，洗涤孔中加入700μL洗涤液，洗脱孔中加入100μL洗脱液。8.3将深孔板放入核酸提取仪内，安装好磁套。8.4运行核酸提取程序：90℃混匀裂解15min；转移磁珠孔中的磁珠至裂解孔，释放磁珠，混匀，再磁吸90s；转移磁珠至第一个洗涤孔，释放磁珠，加热至85℃混匀洗涤2min，磁吸90s；转移磁珠至第二个洗涤孔，释放磁珠，加热至85℃混匀，磁

8、吸30s；转移磁珠至洗脱孔，释放磁珠，加热至85℃混匀洗脱，洗脱时间5min，磁吸90s；转移磁珠至磁珠孔，释放磁珠。8.5程序运行结束后，洗脱孔中的溶液为提取获得的病毒核酸溶液，可立即用于实验检测，也可冷冻保存备用。以上操作也可按等效的磁珠法商品化试剂盒要求进行。9生物安全要求提取结束后，磁套、96孔板等应使用自封口袋进行密闭封存，提取过程及废弃物处理应遵