细胞培养基本知识.ppt

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1、细胞培养基本知识细胞室准备室：用于进行培养器皿的清晰、包装、培养物质的准备和消毒以及供应物品的保藏等.缓冲间：为了减少将外界污染源头带入培养室培养室：是专门用于进行细胞培养和各种无菌操作的实验室。其基本条件是：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。体外培养的设备和器具超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、液氮保存罐、离心机、水纯化装置、高压蒸汽消毒装置、酶标仪过滤除菌装置、手术器械、培养器皿、移液器超净工作台利用鼓风机驱动空气通过高效空气微粒滤层净化后，徐徐通过工作台面，在操作区形成无菌环境。按气流方向的不同分为：1.外

2、流式，2.侧流式CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①使用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒。③箱内灭菌蒸馏水3升，以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。自动双重纯水蒸馏器培养器皿一次性培养瓶和培养板：一般朔料培养器皿的细胞生长面带负电荷，有利于大多数表面带正电荷的细胞贴壁生长玻璃培养瓶、溶液瓶、移液管常用玻璃器皿清洗浸泡：在5%稀盐酸溶液中浸泡12h以上，以达到软化器皿表面所附着物质，并中和器皿表面的碱性物质。刷洗：用软毛毛刷将

3、浸泡后的其面在洗涤剂水中反复刷洗，以除去表面杂质。浸酸：利用强氧化作用清除器皿表面可能残留的有机物,时间在6小时以上最好过夜。冲洗：反复注满水、倒空达20次以上。最后用二次水浸洗2～3次，烘干后包装。清洁液的配制胶塞和塑料用品的清洗先在水中浸泡，然后用2%NaOH溶液煮沸10分钟，自来水冲洗晾干后，再用1%稀盐酸浸泡30分钟，最后分别用自来水和三次水各冲洗3次，烘干备用。过滤除菌装置1.不锈钢板式滤器：2.微孔滤膜滤器：有可换膜式滤器和一次性滤器两大类。细胞培养的概念原代培养：就是初次培养，即培养物一经接种到培养皿中就不再分割

4、，任其生长繁殖而不更换生长器皿。它包括：细胞培养、组织培养、器官培养。传代培养：随着培养时间的延长、细胞分裂繁殖，细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度逐渐减慢甚至停止，在这种情况下，都需要将培养物分割成小的培养。原代培养细胞的生命归宿原代培养期传代培养期衰退期体外细胞培养物的生长类型贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。每代贴附生长细胞的生长过程游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈

5、圆球形。贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束潜伏期：此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。其机制：接触抑制、密度依赖性。传代的方法根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。1.悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000r/min）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2.半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细

6、胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3.贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶贴壁生长细胞传代方法1.吸光培养瓶中的培养液,用PBS溶液清洗2-3次。2.加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10min（显微镜下动态监测）。3.吸去胰蛋白酶液，加入培养液。4.用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。5.吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。6.加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。

7、7.将后者放入培养箱中培养。培养细胞生长的条件1.细胞的营养需要2.细胞的生存环境温度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4渗透压3无污染4无毒细胞培养用液水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl8.00gKCl0.20gNa2HPO4·H2O1.56gKH2PO40.20g加水至1000mlPH值调至7.2-7.4消化液1.胰蛋白酶：主要用的是0.25％胰蛋白酶液，胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液

8、配制，过滤除菌。它作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。用含血清培养液终止其消化作用。2.EDTA：是一种化学螯合剂，对细胞有一定的解离作用。毒性小、价格便宜、使用方便。3.胶