医学微生物-—病毒感染的检查方法与防治原则.ppt

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1、病毒感染的检查方法与防治原则广州医科大学临床微生物检验教研室吴爱武第一节病毒感染的检查方法一、标本采集与送检原则：与细菌类似用于分离培养的标本：采取采取急性期标本、使用抗生素处理防细菌污染无菌操作、低温保存、尽快送检血清学诊断的标本：双份血清？标本的采集和送检六原则早期采集无菌采集采集合适的标本采集双份血清正确标记尽快送检标本类型？好的标本？标本内容物一般需要含有宿主细胞与细菌标本类似正常无菌性体液二、病毒的分离培养与鉴定动物接种鸡胚培养细胞培养病毒成分检测血清学诊断病毒的实验室诊断方法分离培养方法（金标准）活细胞病毒

2、检测（一）病毒的分离培养1.动物接种最原始的病毒培养方法多用于没有敏感细胞进行细胞培养的病毒（乙肝、丙肝、丁肝、戊肝病毒等）选择敏感动物及适宜接种部位,如：狂犬病毒可接种于小鼠脑内痘病毒可接种于家兔角膜或皮内。2.鸡胚培养一般采用孵化9--14天的鸡胚最常用的鸡胚接种部位有尿囊腔接种绒毛尿囊膜接种:痘类V（含天花V）、疱疹V尿囊腔接种：流感V、腮腺炎V羊膜腔接种：流感V初次分离卵黄囊接种:嗜神经V可用鸡胚培养的病毒种类：鸡胚接种尿囊腔接种羊膜腔接种流感病毒流感病毒尿液羊水血凝及血凝抑制试验鉴定病毒鸡胚尿液+红细胞血凝鸡

3、胚羊水+特异抗体+RBC血凝被抑制3.细胞培养（最常用）标本原代细胞传代细胞系细胞病变（CPE)血细胞吸附pH值改变等特异性抗体鉴定二倍体细胞株单层细胞培养悬浮细胞培养病毒增殖的表现原代细胞培养(primarycellculture)概念：来源于人胚胎、动物、鸡胚等组织细胞称为原代细胞株。制备：用胰蛋白酶将人胚（或动物胚、鸡胚）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1--2天后逐渐在培养瓶壁长成单层细胞。接种病毒后进行培养即原代细胞培养。特点及作用：原代细胞均为正常二倍体细胞，但不能持续传代培养，对病毒的敏感性高，

4、可用于生产病毒疫苗。如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊髓灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。细胞培养瓶贴壁生长的单层细胞二倍体：凡是由受精卵发育而来，且体细胞中含有父本和母本两个染色体组的生物个体。其体细胞即二倍体细胞。二倍体细胞培养(diploidcellculture)概念：原代细胞只能传2--3代细胞就退化，在多数原代细胞衰老退化时，少数细胞能继续活下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞株。特点：二倍体细胞生长迅速，并可传50代保持二倍体特征，通常是胚胎

5、组织的成纤维细胞（如WI-38细胞系）。保存：二倍体细胞一经建立，应尽早将细胞悬浮于10%二甲基亚砜中，大量分装安瓿贮存于液氮（-196℃）内，作为“种子”，供以后传代用。作用：目前多用二倍体细胞系制备病毒疫苗，也用于病毒的实验室诊断工作。传代细胞培养(continouscellculture)概念：由癌细胞或二倍体细胞突变而来，染色体数为非整倍体，细胞生长迅速，可无限传代的细胞称传代细胞株，在液氮中能长期保存。种类：常用的传代细胞有HeLa（宫颈癌）细胞、KB（口腔癌）细胞、HEp-2（喉癌）细胞、Vero（非洲绿猴

6、肾）细胞等。特点及作用：由于传代细胞系能有规律地持续传代，容易保存（-70℃~-196℃）且对某些病毒易感，因此，在诊断、科研等非疫苗生产的项目中常被采用。目前广泛用于病毒的实验室诊断工作，根据病毒对细胞的亲嗜性，选择敏感的细胞系使用传代细胞系细胞病变（CPE)血细胞吸附病毒干扰培养液代谢改变等特异性抗体鉴定病毒在细胞内增殖的指征病毒在细胞内增殖的指征（1）细胞的变化—CPE细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落等。多核巨细胞(融合细胞)有些病毒(如狂犬病病毒、麻疹病毒等)可在培养细胞中形成胞浆和/或核内的包涵体。病毒在细胞

7、内增殖的指征正常细胞病变细胞（1）CPECPE：①细胞变圆、聚集、皱缩、溶解或脱落CPE:②麻疹病毒感染形成多核巨细胞CPE:③形成包涵体（Negribody—细胞质内）CPE:③巨细胞病毒包涵体(细胞核、质中均存在）(2)红细胞吸附病毒在细胞内增殖的指征（3)干扰现象(interference)一种病毒感染细胞后可以干扰其后感染的另一病毒在该细胞的增殖，这种现象叫干扰现象。如：风疹病毒感染Vero细胞时CPE不明显，但它能干扰随后感染的埃可病毒(ECHOV)的增殖，从而阻抑后者所特有的CPE。少用（4）细胞代谢的改变

8、培养液的pH值改变（二）病毒的鉴定1.病毒形态学鉴定：电镜2.病毒血清学鉴定：用已知病毒抗体检测3.病毒分子生物学鉴定：检测病毒基因或成分（三）病毒数量和感染性测定1、TCID50(50%tissuecultureinfectiousdose）系列稀释的病毒液感染细胞后，引起50%（半数）组织细胞发生死亡或病变的最高病毒稀释度。以