生物工艺原理第二版课件 教学课件 作者 贺小贤 主编 课件工艺原理第五章2 .ppt

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1、第二节好氧发酵产物积累机制好氧性发酵(aerobicfermentation)：在发酵过程中需要不断地通入一定量的无菌空气，如：利用黑曲霉进行柠檬酸的发酵、利用棒状杆菌进行谷氨酸的发酵、利用黄单孢菌进黄原胶－多糖的发酵等等．糖的分解代谢包括糖酵解（糖的共同分解途径）和三羧酸环（糖的最后氧化途径）。一、柠檬酸的发酵机制1.柠檬酸的发酵机制黑曲霉(Asp.niger)原料：sugar，alcohol，aceticacid途径：EMP（HMP）丙酮酸羧化TCA环黑曲霉生长，EMP与HMP途径的比率是2：1，生产柠檬酸时为4：1。葡萄糖柠

2、檬酸(citricacid)理论转化率106.7%R目的产物提供4C化合物TCA循环柠檬酸的生物合成途径CO2阻断AMPPiNH4+ATPcitrateNH4+k+激活抑制12（1）糖酵解及丙酮酸代谢的调节第一个调节的酶是磷酸果糖激酶(PFK)：AMP、无机磷、NH4+对该酶有活化作用ATP、柠檬酸对该酶有抑制作用2.柠檬酸生物合成的代谢调节Q：PFK在正常生理条件下能被柠檬酸抑制，但在柠檬酸发酵中，柠檬酸浓度很高，为什么EMP途径仍能保持畅通呢？PFK是一种调节酶，其活性受柠檬酸的强烈抑制，必须解除。微生物体内的NH4+,可以

3、解除柠檬酸对PFK的反馈抑制作用，在较高的NH4+,浓度下，细胞可以大量形成柠檬酸。柠檬酸生产菌—黑曲霉如果生长在Mn2+缺乏的培养基中，蛋白质的合成受阻，导致细胞内NH4+浓度足够高，可达到26mmol/L,从而解除了柠檬酸对对PFK的反馈抑制，使得葡萄糖源源不断地合成大量的柠檬酸。第二个调节的酶是丙酮酸激酶（PK）PK可被NH4+、K+激活磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸＋ATP二氧化碳的固定反应参与二氧化碳固定反应的酶：---丙酮酸羧化酶---磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶---草酰乙酸获得补充（2）TCA环的调节柠檬酸合成酶是该途径的第一个限

4、速酶，由乙酰辅酶Ａ中的高能硫酯键水解释放大量能量，推动合成柠檬酸。柠檬酸　　　顺乌头酸　　　异柠檬酸两步反应均由顺乌头酸酶催化，该酶需要Fe2+，若用络合剂除去反应液中的铁，则酶活性被抑制，造成柠檬酸的积累。顺乌头酸水合酶在催化时建立如下平衡柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸＝90：3：7黑曲霉中TCA循环中的另一个特点是－酮戊二酸脱氢酶被葡萄糖和NH4+抑制，在柠檬酸生成期，菌体内不存在－酮戊二酸脱氢酶或活力很低。能荷调节柠檬酸产生菌可以在有氧的条件下大量生成柠檬酸，也就是说，NADH即被氧化了，又没有产生ATP，为什么？能够正常产

5、生ATP的呼吸链称之为标准呼吸链。标准呼吸链的存在使得菌体在代谢过程中产生了大量的ATP，用于菌体自身的生长，这种现象，在生产上通常称之为只长菌不产酸，大量的葡萄糖被消耗了，却没有生产出柠檬酸。能荷调节对柠檬酸发酵的影响设想：该菌体内存在一条侧系呼吸链，NAD(P)H经过该呼吸链，可以正常的传递H+，将其氧化为H2O，但是并没有氧化磷酸化生成ATP。大量的实验证明，在柠檬酸发酵的黑曲霉中，确实存在一条这样的侧系呼吸链，该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧。如果在柠檬酸的发酵过程中，发酵液的溶氧浓度在很低的水平维持一段时间，或者在这期间中断

6、供氧一段时间，则这一侧系呼吸链不可逆的失活，其结果产生了大量的菌体，而柠檬酸的产率很低。积累柠檬酸应采取的措施想方设法提高柠檬酸合成反应所需酶的活力；必须切断柠檬酸的去路；顺乌头酸酶失活，ＴＣＡ环阻断。保证中间产物的供给；草酰乙酸的及时供给，丙酮酸二氧化碳固定反应对柠檬酸CO2积累有重要意义。乙酰COA草酰乙酸CO2柠檬酸发酵需要下述环境条件：磷酸盐浓度低；氮源为NH4+盐；pH值低（低于2.0）；溶氧量高；Mn2+、Fe2+、Zn2+含量极低。柠檬酸发酵中黑曲霉对Mn2+极端敏感。黑曲霉在缺锰的条件下发酵，细胞有生理和代谢的变化

7、，微生物体内的NH4+水平高，细胞可以大量形成柠檬酸。Mn2+的效应可以认为是NH4+水平升高而减弱了柠檬酸对EMP途径关键酶（PFK）的抑制。由于TCA循环降低，ATP的生成减少，蛋白质和核酸合成受阻，细胞内的NH4+异常高，从而降低了柠檬酸对PFK的抑制。柠檬酸发酵的控制关键：EMP畅通无阻：控制锰离子，提高胞内NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的抑制，控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。阻断柠檬酸向下的代谢：阻断顺乌头酸酶的催化作用，该酶是个含铁的非血红蛋白，以Fe4S4作为辅基。因此，在菌体生长到足够菌数时，适量加入亚铁氰化钾（黄

8、血盐），使与铁硫中心的Fe2+生成络合物，则该酶失活或活性减少，而积累柠檬酸。通过诱变造成生产菌种顺乌头酸酶的缺损或活力很低，同样积累柠檬酸。保证C4二羧酸的及时补充固定CO2外加草酰乙酸选育回补途径旺盛的菌种。柠檬酸发酵的产率葡萄糖经过EMP途经