生物工艺原理第二版课件 教学课件 作者 贺小贤 主编 课件工艺原理第十章课件.ppt

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1、第七章固定化酶和固定化细胞第一节固定化酶的概念机制备原则第二节固定化酶的制备方法第三节固定化酶的性质第四节固定化细胞固定化酶的概念：所谓固定化酶(immobilizedenzyme)，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶柬缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用；过去曾称其为水不溶酶或固相酶。第一节固定化酶的概念机制备原则1916年，Nelson和Griffin发现酶的固定化现象；1969年，千畑一郎等将固定化氨基酰化酶应用于生产L-氨基酸，开创了固定化酶应用于工业生产的先例

2、；1971年召开的第一届国际酶工程会议上，建议采用统一的英文名称ImmobilizedEnzyme；1973年，固定化大肠杆菌菌体中的天冬氨酸酶连续生产L-天冬氨酸。1986年，利用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相继获得成功。酶固定化技术发展史从目前的发展状况来看，尽管酶种类繁多，但已经固定化的酶却相对有限，采用固定化酶技术大规模生产的企业尚属少数，真正在工业上使用的固定化酶还仅限于葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等为数不多的十几个酶种，故仍需大力研究开发使更多的固定化酶和细胞能适用于工业规模生产。发展现状固定化酶的优点同一批固定化酶能在工艺流程中重

3、复多次地使用；固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；稳定性显著提高；可长期使用，并可预测衰变的速度；提供了研究酶动力学的良好模型。固定化酶的制备原则（1）必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。（2）酶与载体必须有一定的结合程度。酶的固定化既不影响酶的原有构象，又能使固定化酶能有效回收贮藏，利于反复使用。（3）固定化应有利于自动化、机械化操作。这要求用于固定化的载体必须有一定的机械强度，才能使之在制备过程中不易破坏或受损。（4）固定化酶应有最小的空间位阻。（5）固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程中，所选载体应不和底物、产物或反应液

4、发生化学反应。（6）固定化酶的成本适中。第二节固定化酶的制备方法固定化酶（细胞）的制备方法酶和细胞固定化方法载体结合法交联法包埋法网格型微囊型物理吸附法离子结合法共价结合法热处理（细胞）一、吸附法通过载体表面和酶分子表面间的次级键（包括范德华力、疏水相互作用、氢键）相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中最简单的方法。吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。物理吸附法(physicaladsorption)是通过非特异性物理吸附作用将酶直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。物理吸附法常用的载体：有机载体：纤维素、胶原、淀粉及面筋等；无机载体：活性炭、氧化铝、皂土、多孔

5、玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。物理吸附法离子吸附法(ionadsorption)是通过离子键使酶与含有离子交换基团的水不溶性载体相结合的固定化方法。离子吸附法具有操作简便、条件温和、酶活力不易丧失等优点。此外，吸附过程同时可以纯化酶。此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、β-淀粉酶、纤维素酶等，在工业上用途较广。离子吸附法离子吸附法常用的载体：阴离子交换剂：二乙基氨基乙基(DEAE）-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、DEAE—葡聚糖凝胶等；阳离子交换剂：有羧甲基(CM)-纤维素、纤维素柠檬酸盐、Dowex-50等。其吸附容量一般大于物理吸附剂。DEAE—纤维素吸

6、附的α—淀粉酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶。E.G.DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶：将DEAE-SephadexA25充分溶胀,用0.5mol/LNa0H和水洗涤后，加入pH7.0-7.5的米曲霉3042粗酶液(水解乙酰—DL-Ala活力为25umol/m1·h)充分混合(1g湿重载体加60mL酶液)后，于低温下搅拌过夜后，吸去上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗涤固定化酶，置4℃备用。固定化酶活力回收50-60％，水解乙酰—DL—A1a活力为600-800umol/g·h湿固定化酶。二、包埋法包埋法（entrapment）是将酶包埋在高聚物的细微凝

7、胶网格中或高分子半透膜内的固定化方法。前者又称为凝胶包埋法，酶被包埋成网格型；后者又称为微胶囊包埋法，酶被包埋成微胶囊型。（1）凝胶包埋法将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合促进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成凝胶或树脂。E.G.1聚丙烯酰胺凝胶包埋将1mL酶溶液溶于适当缓冲液,加入含有750mg丙烯酰胺(单体)和40mgN，N’—甲叉双丙烯酰胺(交