各种PCR介绍ppt课件.ppt

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1、聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)1根据细胞分裂中DNA半保留复制机理，在体外快速扩增某一特定DNA片段的方法。2PCR工作原理以要扩增的DNA分子为模板，以一对与模板5`末端和3`末端互补的寡核甘酸片段为引物4种脱氧核糖核甘酸存在的条件下依赖DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR特异性取决于引物和模板DNA结合特异性。3体外(试管中)扩增特异DNA片段短时间内即可将所需目的DNA片段扩增至100万倍以上PCR技术特点敏感度高、特异性强、产率高、重复性好、操作简便、快速4PCR体系基本组成模板DNA：（102-5）拷

2、贝dNTP底物：20—200umol/L特异性引物：0.1—0.5umol/LDNA聚合酶：KlenowT4、T7聚合酶TaqDNA聚合酶:耐热稳定性、5`-3`聚合酶活性及3`-5`外切酶活性，可校正PCR反应中某些单核甘酸的错配。含Mg2+的缓冲液：Mg2+能影响反应特异性和扩增片段的产率，一般为1.5—2.0mmol/L，过量将增加非特异性条带的产生。5循环次数取决于模板DNA的浓度30次—扩增100万倍6反应分三步：1变性denaturation：加热90-95℃，模板DNA双链解离形成单链DNA；2退火annealling：温度突然

3、降低,引物与模板DNA结合,40-60℃,Tm值{4（G+C）+2（A+T）}-5℃.3延伸extension：TaqDNA聚合酶以4dNTP为底物，在Mg2+存在的条件下，催化DNA合成。70-75℃时间---要扩增片段长度决定7待扩增片段：1000bp引物Tm＝55℃DNA模板变性:94℃,5分钟;PCR循环(30次):94℃,30秒;50℃,45秒;72℃,1分钟;最终延伸:72℃,10分钟PCR反应条件的设定8PCR产物的检测琼脂糖凝胶电泳；分子杂交；限制性内切酶酶切分析；微孔板夹心杂交法；直接测序9PCR产物的检测-琼脂糖凝胶电泳P

4、CR产物PCR产物10PCR技术的应用1.基础研究(1)基因或cDNA克隆：从基因数据库中获得某一基因或cDNA的核苷酸序列，用PCR方法扩增并克隆该基因或cDNA。(2)基因表达：用RT-PCR检测某一特定基因在转录水平的表达。2.医学(1)感染性疾病病原体的诊断：HIV、结核分枝杆菌、乙肝病毒等。(2)遗传病相关基因的检测：镰刀型细胞贫血、血友病。(3)恶性肿瘤的诊断3.基因动、植物的检测(1)转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。(2)转基因植物的检测：玉米、大豆等。11PCR新技术RT-PCR：用于RNA分析梯度PCR：可用于找

5、出最适合的退火温度反向PCR：可对未知序列扩增后进行分析不对称PCR：用于制备单链DNA多重PCR：加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段降落PCR：用于PCR条件的优化，避免非特异性序列的扩增实时定量PCR(RealTimeQuantitativePCR,qRT-PCR)巢式PCR：使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段12反转录PCR(RT-PCR)RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。135’3’AAAAA5’3’5’3’3’5’5'3’3'5’5’3’RT-PCR

6、原理mRNA1stcDNA逆转录酶、下游引物、dNTPsTaqDNA聚合酶、上游及下游引物、dNTPs5’5’3’3’特异PCR产物5’5’3’3’经30个循环，产生230个分子拷贝5’5’3’3’14一步法RT-PCRRT反应与PCR反应在同一个试管中进行。两步法RT-PCRRT反应与PCR反应在不同的试管中进行。下游引物特异性引物Oligo(dT)15降落PCR（TouchdownPCR）用来避免非特异性序列的扩增PCR中引物的黏合温度(annealingtemperature)决定了黏合的特异性，温度越高特异性越强，但过高则不能实现引物

7、和模板的结合，而过低会产生大量非特异性产物。因此进行PCR时需要寻找合适的黏合温度。降落PCR开始先设定一个比较高的黏合温度，每个循环黏合温度下降1℃，到一个较低温度以后每个循环的黏合温度保持不变直到结束。在刚下降到特异性结合可以进行的最高温度时，可以达到最高的特异性。这样在起初的几个循环中，特异性扩增序列可以相对非特异性序列多扩增若干倍，从而减轻非特异性扩增对结果的干扰。这种方法可用于省去多次试验最佳黏合温度的工作。16反向PCR(InversePCR,IPCR)扩增引物相反方向DNA序列的技术。用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的

8、片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段.实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连