实时荧光定量PCR介绍ppt课件.ppt

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1、实时荧光定量PCR介绍宝生物工程（大连）有限公司7/28/2021主要内容RealTimePCR基础知识12RealTimePCR实验方法3RealTimePCR解析方法4RealTimePCR应用实例实时荧光定量PCR介绍27/28/2021RealTimePCR基础知识1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的检测方法RealTimePCR基础知识1实时荧光定量PCR介绍37/28/2021RealTimePCR的用途RealTimePCR用途定性分析定量分析病毒及病原菌定量分析导

2、入基因拷贝数解析GMO定量检测差异显示结果验证基因芯片结果验证siRNA效果确认mRNA表达量分析病毒及病原菌检测物种鉴定基因分型绝对定量相对定量实时荧光定量PCR介绍47/28/2021RealTimePCR的原理激发光发射光使用RealTimePCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。RealTimePCRCt值实时荧光定量PCR介绍57/28/2021RealTimePCR基础知识1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的检测方法RealTimePCR基础知识1实时荧

3、光定量PCR介绍67/28/2021TaqManProbeCyclingProbeMolecularBeaconetc.SYBRGreenI荧光染料嵌合法荧光探针法RealTimePCR的检测方法实时荧光定量PCR介绍77/28/2021荧光染料嵌合法（SYBRGreenI）SYBRGreenI：是一种能结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenI实时荧光定量PCR介绍87/28/2021Primer退火FFFFSYBRGreenI法作用机理示意图Pol.FPrimerPo

4、l.延伸FFFFFFPrimer热变性FFFF实时荧光定量PCR介绍97/28/2021TaqMan法作用机理TaqMan探针为一寡核苷酸，5’端标记一个报告基团（Reporter），3’端标记一个淬灭基团（Quencher）。RQ实时荧光定量PCR介绍107/28/2021RQPrimerRQPrimerRQPrimerPol.Pol.热变性退火延伸TaqManProbe法原理示意图实时荧光定量PCR介绍117/28/2021One-StepRT-PCR特异性高多重PCR检出Probe设计要求高Probe法

5、Probe合成费用高SYBRGreenI法与Probe法比较常用于mRNA表达量分析等SYBRGreenI法简便易行价格便宜要求反应的特异性不能进行多重PCR常用于SNP解析，病毒、病源菌检测实时荧光定量PCR介绍127/28/2021主要内容2RealTimePCR实验方法反转录反应RealTimePCR反应实时荧光定量PCR介绍137/28/2021RTPrimer的选择RandomPrimerOligodTPrimerGeneSpecificPrimerRandom6merPrimerGeneSpeci

6、ficPrimerOligodTPrimerPCRR-PrimerPCRF-Primer实时荧光定量PCR介绍147/28/2021目的片段在距Poly(A)Tail1.5kbp以内适用，RT效率较高。OneStepRT-PCR只能使用GeneSpecificPrimer，但不适用于复数基因的检出。5’3’GeneSpecificPrimer目的片段RFAAA···5’3’目的片段RF1,500baseOligodTPrimerRandom目的片段5’3’RF目的片段在mRNA任何位置都能使用。通常mRNA表

7、达量分析最适。OligodTPrimer5’3’RFAAA···目的片段Random适用于mRNA表达量分析，提升反应检测的灵敏度。RTPrimer的选择实时荧光定量PCR介绍157/28/2021RealTimePCR引物设计目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。RealTimePCR用引物与普通PCR引物设计要求不同=>对引物设计要求严格普通PCR引物RealTimePCR引物实时荧光定量PCR介绍167/28/2

8、021两条引物的Tm值尽量接近，应用专用软件计算Tm值★★★Tm值40-60%(最好45-55%)★GC含量Primer长度80-150bp(尽量限制在300bp以内)★扩增片段大小★17-25base使用BLAST检索，确认引物特异性★★★特异性△引物内部或两条引物之间避免3base以上的互补序列△引物3’末端避免2base以上的互补序列★★★互补性3’末端序列△整体上碱基不能过偏△个别部分避免G