蛋白质测定方法.docx

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1、蛋白质的定量测定——微量凯氏定氮法(microKjeldahlmethod)生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法.实验原理生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮

2、法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。其原理如下：1.消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步约需30min至1h，视样品的性质而定。2.加碱蒸馏：硫酸铵与NaOH(浓)作用生成(NH4)OH,加热后生成NH3,通过蒸馏导入过量酸中和生成NH4Cl而被吸收。3.滴定：用过量标准HCl吸收NH3，剩余的酸可用标准NaOH

3、滴定，由所用HCl摩尔数减去滴定耗去的NaOH摩尔数，即为被吸收的NH3摩尔数。此法为回滴法，采用甲基红卫指示剂。HCl＋NaOHNaCl+H2O本法适用于0.2~2.0mg的氮量测定。1.热源2.烧瓶3.玻璃管4.橡皮管5．玻璃杯6.棒状玻塞7.反应室8.反应室外壳9.夹子10.反应室中插管11. 冷凝管 12.锥形瓶13.石棉网微量凯氏蒸馏装置示意图试剂和器材一、试剂浓硫酸；30％过氧化氢溶液；10M氢氧化钠；0.01M的标准盐酸；标准硫酸铵（0.3mg氮/mL）催化剂：硫酸铜：硫酸钾＝1：4混合，研细。指示剂：0.1％甲

4、基红乙醇溶液。二、测试样品牛血清白蛋白。三、器材微量凯氏定氮仪；移液管1mL（×3）；2mL（×1）；微量滴定管5mL（×1）; 烧杯200mL（×2）；量筒10mL（×1）；三角烧瓶150mL（×4）；凯氏烧瓶50mL（×4），吸耳球（×1）；电炉；分析天平。操作方法一、样品处理称取牛血清白蛋白50mg，加入2个凯氏烧瓶中，另2个凯氏烧瓶为空白对照，不加样品。分别在每个凯氏烧瓶中加入约500mg硫酸钾－硫酸铜混合物，再加5mL浓硫酸。二、消化将以上4个凯氏烧瓶置于通风橱中电炉上加热。在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈

5、。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化,使瓶内液体微微沸腾，大约维持2~3h。待消化液变成褐色后，为了加速完成消化，可将烧瓶取下，稍冷，将30％过氧化氢溶液1~2滴加到烧瓶底部消化液中，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成透明淡蓝绿色，消化即告完成。冷却后将瓶中的消化液倒入50mL容量瓶中，并以蒸馏水洗涤烧瓶数次，将洗液并入容量瓶中，定容备用。三、蒸馏1.蒸馏器的洗涤蒸气发生器中盛有加有数滴H2SO4的蒸馏水和数粒沸石。加热后，产生的蒸汽经贮液管、反应室至冷凝管，冷凝液体流入接受瓶。每次使用前，

6、需用蒸汽洗涤10分钟左右（此时可用一小烧杯承接冷凝水）。将一只盛有5mL2％硼酸液和1~2滴指示剂的锥形瓶置于冷凝管下端，使冷凝管管口插入液体中，继续蒸馏1~2分钟，如硼酸液颜色不变，表明仪器已洗净。2.消化样品及空白的蒸馏取50mL锥形瓶数个，各加25mL0.01M标准HCl和1~2滴指示剂，用表面皿覆盖备用。取2mL稀释消化液，由小漏斗加入反应室。将一个装有0.01M标准HCl和指示剂的锥形瓶放在冷凝管下，使冷凝器管口下端浸没在液体内。用小量筒量取5mL10MNaOH溶液，倒入小漏斗，让NaOH溶液缓慢流入反应室。尚未完全

7、尽时，加紧夹子，向小漏斗加入约5mL蒸馏水，同样缓缓放入反应室，并留少量水在漏斗内作水封。加热水蒸气发生器，沸腾后，关闭收集器活塞。使蒸汽冲入蒸馏瓶内，反应生成的NH3逸出被吸收。待氨已蒸馏完全，移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，并用少量蒸馏水冷凝管口。取下锥形瓶，以0.01MNaOH标准溶液滴定。记下所耗去的体积。3.蒸馏后蒸馏器的洗涤蒸馏完毕后，移取热源，夹紧蒸汽发生器和收集器间的橡皮管，此时由于收集器温度突然下降，即可将反应室残液吸至收集器。·标准样品的测定在蒸馏样品及空白前，为了练习蒸馏和滴定操作，可用标准硫酸铵试

8、做实验2~3次。标准硫酸铵的含氮量是0.3mg/mL，每次实验取2.0mL。四、计算样品的含氮量（mg/mL）=若测定的蛋白质含氮部分只是蛋白质（如血清），则：样品中蛋白质含量（mg/mL）＝式中：A为滴定空白用去的NaOH平均mL数，B为滴定样品用去的NaOH平均mL数，V