蛋白质含量测定方法的研究.docx

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1、蛋白质含量测定方法的研究一．研究背景及目的：目前我们有四种常用的测定蛋白质含量的方法：凯氏定氮法，考马斯亮蓝法，紫外法，Folin-酚法。这就涉及到我们在实际操作中如何选择的问题。为了解决这个问题，我们有必要知道蛋白质含量的测定过程中，什么因素影响了测定。我们如何避免或将这种影响降到最小。本实验的目的就是：通过对各种实验原理的掌握和实际操作，了解各方法测量的影响因素，从而在日后的实验中根据不同的情况选取合适的科学方法，达到既能排除其他因素的干扰，又能科学准确，灵敏快速的测出蛋白质含量，最好是最大限度的降低样品的消耗。二．实验原理：我们在实际操作中如何

2、选择合适的方法?要回答这个问题，首先要回答，影响每种方法测定准确性的因素是什么?为了衡量每种方法测定的准确性，我们设置测定已知浓度的待测液1；为了了解影响测量方法的影响因素，我们本该准备各种成分复杂的待测液。但是限于时间，我们只选取了绿豆芽下胚轴。它的含水量占总重的98%左右，为分裂旺盛的组织，因此核酸含量较高，根据紫外法的测定原理（由于酪氨酸和色氨酸共轭双键，因此有吸收紫外光的特性），我们推测绿豆芽下胚轴内含的核酸可能会影响到测定结果的准确性。这一推测，可通过对比考马斯亮蓝，Folin-酚法和紫外法测得的蛋白质含量的数值来得到印证。通过查找资料【1

3、】考马斯亮蓝，Folin-酚法，我们推测他们测定的待测液2的蛋白质浓度应该是可以取信的，不过这个还需要实验数据的论证。由于这三种方法都属于比色法，以朗伯-比尔定律为理论支持。具体每种测定方法的操作思路是，通过测定一系列已知浓度的蛋白质溶液的吸光度，制作标准曲线，通过的定待测液的吸光度，在标准曲线中查找到相应的蛋白质浓度。三．实验仪器与试剂：仪器：722-分光光度计（上海分析仪器总厂）；UV9600紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；架盘药物天平JP-100（上海精密科学仪器有限公司）；微量可调手动移液器(大龙牌)；具塞试管（15ml）;漏斗；研钵

4、试剂：1mg/ml牛血清蛋白（BSA）标准液；试剂甲；试剂乙；考马斯亮蓝G-250溶液；待测液1（500μg/mlBSA标准液）材料：绿豆芽下胚轴四．实验方法：①制备待测液2：将绿豆芽去掉根部和头部，只留下胚轴均匀的白色部分。用架盘天平称取1.5g。放入研钵中，加入少量的石英砂（亦可不加），仔细研磨至下胚轴消失，材料呈匀浆状。将材料小心转入50ml容量瓶中，少量多次使用蒸馏水，定容。定容后颠倒浸提10分钟。过滤，收集滤液。②Folin-酚法：管号123456789101112250μg/mlBSA原液（ml）00.20.40.60.81.0待测液1各

5、0.2ml待测液2各1ml蒸馏水1.00.80.60.40.20各0.8试剂甲各5ml，混匀，RT:10min试剂乙各0.5ml，立即混匀，RT:30min根据上表配置溶液。注意加入试剂甲后，至少等10min。加入乙试剂后，可以两个人合作，迅速混匀。测定OD650以BSA浓度（μg/ml）为横坐标，OD650为纵坐标，绘制标准曲线。记录待测液1和待测液2的OD650，取其平均值，从标准曲线中查出待测液蛋白质含量，根据公式计算蛋白质百分含量。③考马斯亮蓝G-250法：管号123456789101112100μg/mlBSA原液（ml）00.20.40.

6、60.81.0待测液1各0.1ml待测液2各1ml蒸馏水1.00.80.60.40.20各0.9mlG-250溶液各5ml，混匀，RT:2min管号1234561000μg/mlBSA原液（ml）用上表第1管0.20.40.60.81.0蒸馏水0.80.60.40.20G-250溶液各5ml混匀，RT2min根据上表配置溶液。测定OD595以BSA浓度（μg/ml）为横坐标，OD595为纵坐标，绘制标准曲线。记录待测液1和待测液2的OD595，取其平均值，从标准曲线中查出待测液蛋白质含量，根据公式计算蛋白质百分含量。设计第二组实验是为了找到朗伯比尔定

7、律的适用浓度。④紫外法：管号12345678910111213141mg/mlBSA原液（ml）00.51.01.52.02.53.04.0待测液1各4ml待测液2各4ml蒸馏水4.03.53.02.52.01.51.00G-250溶液各5ml，混匀，RT:2min根据上表配置溶液。测定前8个管的OD280，以BSA含量（μg/ml）为横坐标，OD280为纵坐标，做出标准曲线。在测定待测液吸光度时，我们不光要测量OD280，还要测量OD260，这是为了证明核酸是否对我们的测量结果产生了影响。影响程度可在稍后算出的OD280/OD260中看出，根据该值

8、，我们能确定是否需要使用校正公式。在测量待测液的OD280和OD260时，注意测完一样待测液后再测量第二样，