解剖果蝇的方法.docx

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1、实验方法：1果蝇成虫CNS的解剖：（1）果蝇的准备选取所需年龄、基因型的果蝇2~4只，放置到通有持续性CO2的平台上，在体视镜下出去翅膀和腿，并切去腹部下段。注意：操作时要小心，以免扯坏胸节内的组织。（2）固定从-20℃取出将先前分装好的4%PFA，在室温下待其充分溶解，然后根据果蝇基因型的种类分装到0.6ml的EP管，并在管壁上标上基因型和日期。将前面处理的果蝇按基因型放到EP管中固定30~60min。（3）清洗待固定好后，3000rpm离心3min，吸去EP管上层的PFA固定液，加入0.6mlPBS缓冲液，3000rpm离心3min，弃去

2、上层液体，再次加入0.6mlPBS缓冲液，3000rpm离心3min，弃去上层液体，这一次要在管底少量液体。（4）解剖在垫有硅胶的培养皿中，加入适量PBS缓冲液。将果蝇从EP管倒出至培养皿。用镊子将果蝇按压到皿底，小心赶走气泡。慢慢将镊子移至胸节部位，沿着腿的根部，轻轻撕开角质膜，使乳白色的胸节神经索（VentralGanglion，VG）暴露。沿着撕开的部位向下滑动镊子，使VG的三节都暴露出来。注意：一定要静下心慢慢解，不要碰VG，以免其破损。用镊子拔去果蝇的口器，此时其乳白色的脑组织就会暴露出来。将镊子探入一侧opticlobe，小心扯去

3、包裹在其上面的角质膜，另一半也同样操作。小心清除脑组织外面的气管和其他脏东西。注意：扯角质膜的力不能太大，以免brain被扯破；清除气管时一定要小心，不要将brain弄坏。（5）后固定将剖出的果蝇CNS转移到装有PFA的EP管上后固定1~3h，然后用PBS缓冲液清洗三遍，每次10~15min。（6）打孔将CNS在加有1%Triton的PBS缓冲液（以下简称为PBST）中处理30min，以增加抗体的穿透性。注意：在染Aβ时，在打孔前要先用70%的甲酸溶液处理CNS，使Aβ的抗原决定簇更多地暴露出来。（7）封闭弃去PBST，加入适量3%BSA，处

4、理1h，以封闭非特异性结合位点。（8）孵育一抗弃去BSA，将一抗（如6E10，抗Aβ的抗体）以1:100的比例在BSA中稀释后，加到EP管盖上，放置到35mm培养皿做的湿盒，放到4℃冰箱孵育过夜。（9）孵育二抗弃去一抗的孵育液，用PBST洗三遍，然后加入以1:100的比例在BSA中稀释的二抗，放置到35mm培养皿做的湿盒，放到4℃冰箱孵育过夜。注意：为了防止荧光淬灭，要在培养皿外面包上锡箔纸。（10）PI（PropidiumIodide）染核弃去二抗的孵育液，用PBST洗三遍，然后加入以1:100的比例在BSA中稀释的PI，处理30min，然

5、后用PBST洗三遍。（11）封片用无水乙醇浸洗载玻片和盖玻片，晾干，并在载玻片上标记果蝇的基因型和日期。取几片盖玻片，用金刚石笔切割成长条状，以搭成放载玻片的小台，从而避免样品被压扁。用200ul的微量移液器将果蝇CNS吸出，滴到载玻片的适当位置，并在体视镜下调整其姿态和位置，晾干。将盖玻片长条摆到样品的两侧，然后在其附近滴加封片剂，以防止荧光不正常淬灭。以合适的角度盖上盖玻片，尽量样品所在位置不要有气泡。在盖玻片周围涂加透明指甲油。（1）Confocalimaging溶液的配制：（1）4%的PFA（Paraformaldehyde，PFA）

6、溶液PFA40gDEPC水~500ml2xPBS~1000ml配法：称取40gPFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器中，持续加热磁力搅拌至60~65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH调pH至7.0，使成清亮状，再加入约500ml的2xPBS，充分混匀（在冰浴或水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。注意：（1）配置时应在通风条件下操作，并避免接触皮肤和吸入（戴手套和口罩），因PFA具有较强的固定作用和毒性、刺激作用；（2）加热时，温度不宜过高，常为60~65℃，否则PFA降解失效；（3）配

7、制好的PFA虽可存放一段时间，但防止过久的液体，固定效果（2）PBS缓冲液NaCl8gKCl0.2gNa2HPO41.42gKH2PO40.27g配法：按上述配方称取各组分，放置于1L烧杯中；向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解；滴加浓盐酸将pH调至7.4，然后加入去离子水将溶液定容为1L；高温高压灭菌后室温保藏。（3）Triton（4）PBST（5）BSA（6）PI