牙髓间充质干细胞生产.doc

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1、牙髓间充质干细胞生产I．目的：建立牙髓间充质干细胞制品生产规程。II．范围：适用于牙髓间充质干细胞的生产；适用于技术部和各中心技术组的所有技术人员。III．职责：1.生产主管负责本制度的执行和监督；2.技术组的所有技术人员要严格按照本流程的要求进行操作；3.监督员负责全程监督，并即时按要求填写《牙髓间充质干细胞生产记录》和《生产试剂耗材记录表》。附表1牙髓/骨髓/脂肪/胎盘/脐带间充质干细胞生产记录附表2生产试剂耗材记录表IV．规程：一、牙髓间充质干细胞原代操作消化法：1.仪器耗材1）10ml移液管2）培养皿3）50ml离心管4）100μm筛网5）T75培养瓶6）15ml离心管2.试剂1

2、）生理盐水2）培养基3）胶原酶3.酶消化法操作流程3.1将浸在含1%双抗的生理盐水中的牙齿取出，吸取运输液4ml交给质检，并填写《样本取样单》，牙齿置于75%酒精中浸泡30min；3.2取出牙齿在含10ml生理盐水的培养皿中清洗2-3遍，用止血钳固定牙冠，持骨钳夹碎牙根部，暴露出牙髓，用镊子取出牙髓并放入含有适量生理盐水的培养皿中；3.3用剪刀将牙髓组织块剪碎成1mm3，转移到50ml离心管中，加入生理盐水至30ml,再加入10ml0.2%胶原酶；3.4置于37℃恒温摇床，180rmp消化30min；3.5用100μm滤网过滤；3.61200rpm离心10min，吸取洗涤液4ml交给质检

3、，并填写《样本取样单》；附表3样本取样单3.7弃剩余上清，调整细胞浓度为107/ml,置于75cm2培养瓶中,放入37℃，CO2培养箱中进行培养。4.组织块法操作流程：4.1将浸在含1%双抗的生理盐水中的牙齿取出，吸取运输液4ml交给质检，并填写《样本取样单》，牙齿置于75%酒精中浸泡30min；4.2取出牙齿在含10ml生理盐水的培养皿中清洗2-3遍，用止血钳固定牙冠，持骨钳夹碎牙根部，暴露出牙髓，用镊子取出牙髓并放入含有适量生理盐水的培养皿中；4.3用剪刀将牙髓组织块剪碎成1mm3，将组织块均匀铺到T25培养瓶（用适量FBS润湿瓶底）瓶底；4.6倒置培养瓶，并加入5ml培养基，放入培

4、养箱中培养；4.712-24h后，将培养瓶轻轻翻转，将牙髓组织块浸入工作液中。二、牙髓间充质干细胞换液1.耗材1）10ml移液管2）15ml离心管2.试剂培养基3.操作流程3.1镜下观察状态细胞；3.2吸取上清液4ml交给质检，并填写《样本取样单》；3.3吸取上清液于50ml离心管中留作精华液（原代培养上清不留），并补充新的培养基；3.4观察细胞并将其置于37℃，5%CO2孵箱中培养。三、牙髓间充质干细胞传代培养1.耗材1）10ml移液管2）50ml离心管3）培养瓶4）15ml离心管2.试剂1）生理盐水2）胰酶3）血清4）培养基3.操作流程3.1显微镜观察，观察培养瓶中的细胞密度到达80

5、%—90%，可进行传代培养；3.2吸取上清液于50ml离心管中留作精华液（原代培养上清不留），T75培养瓶中加入10ml生理盐水洗涤贴壁细胞；3.3吸取洗涤液4ml交给质检，并填写《样本取样单》；3.4倒出剩余洗涤液（生理盐水），再加入10ml生理盐水+0.05%胰酶，进行细胞消化，消化的第一瓶镜下观察，细胞收缩即可加入等体积血清终止消化；3.5将细胞收集到50ml离心管中，1200rpm，6min，弃上清，重悬，加入培养基，然后按照1:2或1:3进行传代。四、牙髓间充质干细胞成品制备1.耗材1）10ml移液管2）50ml离心管3）15ml离心管4）西林瓶/输血袋2.试剂1）生理盐水2）

6、胰酶3）血清4）干细胞保存液3.操作流程3.1待细胞扩增总数达所需细胞数量后，吸取上清液于50ml离心管中留作精华液（原代培养上清不留），T75培养瓶中加入10ml生理盐水洗涤一遍；3.2加入10ml生理盐水+0.05%胰酶，进行细胞消化，消化的第一瓶镜下观察，细胞收缩即可加入等体积血清终止消化；3.3将细胞收集到50ml离心管中，1200rpm，10min；3.4弃上清，细胞沉淀用30ml生理盐水洗涤二次，1200rpm，室温离心10min。3.5取第二次洗涤离心后的上清20ml交给给质检部分，并填写《样本取样单》；3.6用干细胞保存液/生理盐水重悬细胞，转入专用的无菌西林瓶/生理盐水

7、中，封口，贴标签，放置4℃保存。3.7完成初包装后，操作员立即将成品送交包装部门。五、牙髓间充质干细胞的冻存1.耗材1）10ml移液管2）50ml离心管3）15ml离心管4）冻存管2.试剂1）生理盐水2）胰酶3）血清4）冻存液3.操作流程3.1将制备好的MSC于1200rpm室温，离心10min。3.2弃去上清，将细胞悬浮于适量冻存液中，使细胞浓度在107个细胞/毫升，置于低温无菌冻存管中。3.3将细胞交给库管员经过程控降温后于液氮