引物限制合成测序分析PCR产物单倍型的研究.pdf

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1、学校代码：10286分类号：R318密级：公开UDC：577学号：153825引物限制合成测序分析PCR产物单倍型的研究研究生姓名：王柳导师姓名：肖鹏峰教授申请学位类别工学硕士学位授予单位东南大学一级学科名称生物医学工程论文答辩日期2018年5月24日二级学科名称学位授予日期20年月日答辩委员会主席孙啸评阅人孙啸吴旭平2018年6月2日硕士学位论文引物限制合成测序分析PCR产物单倍型的研究专业名称：生物医学工程研究生姓名：王柳导师姓名：肖鹏峰教授本论文获国家自然科学基金（61571114）资助。HAPLOTYPE-CONT

2、AINEDPCRPRODUCTSANALYSISBYSEQUENCINGWITHSELECTIVERESTRICTIONOFPRIMEREXTENSIONAThesisSubmittedtoSoutheastUniversityFortheAcademicDegreeofMasterofEngineeringBYWANGLiuSupervisedbyProf.XIAOPengfengSchoolofBiologicalSciencesandMedicalEngineeringSoutheastUniversityApril

3、2018东南大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：日期：东南大学学位论文使用授权声明东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、《中国学术期刊（光盘版）》电子杂志社有限公司、万方数据电子出版社、北京万方数据股份有限公司

4、有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布（包括以电子信息形式刊登）论文的全部内容或中、英文摘要等部分内容。论文的公布（包括以电子信息形式刊登）授权东南大学研究生院办理。研究生签名：导师签名：日期：中文摘要中文摘要论文题目：引物限制合成测序分析PCR产物单倍型的研究作者姓名：王柳导师姓名：肖鹏峰教授学校名称：东南大学目前，单倍型分析是进行全基因组多态性的连锁不平衡分析，寻找致病基因

5、和进行染色体结构研究的重要手段。然而，现有的单倍型分析方法，如单分子稀释，克隆和等位基因特异性聚合酶链式反应（AS-PCR），相比基因分型，要更加繁琐和昂贵。本论文提出一种二倍体生物PCR产物单倍体分型的策略，即先对PCR产物包含的相邻两个SNP位点进行基因分型：如果其中任何一个位点为纯合子，单倍型都可以通过基因分型来确定；如果两个位点均为杂合子，其可能的单倍型有两种组合，样本包含的单倍型需要进一步的分析。针对待测样本中含有两个相邻的杂合SNPs的情况，我们提出一种引物选择合成测序分析PCR产物单体型的方法。首先，采用等位

6、基因特异性引物进行引物测序，即用3′末端杂交到第一个SNP位点的等位基因特异性引物进行引物选择性限制，正确匹配的引物继续延伸测序确定PCR产物的单倍型；其次，针对某些等位基因特异性引物会产生非特异性延伸的情况，采用封闭特定引物的测序方法，即当测序引物杂交到DNA模板后，先通过加入特定的双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）到测序体系中，如果加入的ddNTP与DNA模板互补，则测序引物被封闭。反之，未被封闭的引物可以采用焦磷酸测序或Sanger测序获得单倍型分析结果。为验证该上述思路的可行性，挑选Gilbert综合征相关的UGT

7、1A1*6(rs4148323)和UGT1A1*28(rs8175347)以及帕金森病相关的K1637K(rs11176013)和S1647T(rs11564148)四个SNPs位点为研究对象。包含UGT1A1*6和UGT1A1*28两个相邻位点的PCR产物单倍型，通过加入等位基因特异性引物后直接进行Sanger测序被确定。由于测序引物产生非特异性延伸的两个相邻位点K1637K和S1647T，通过加入ddNTP选择性封闭引物进行焦磷酸测序，成功获得单倍型结果。实验结果表明，本方法简单快速，不受焦测序读I东南大学硕士学位论文

8、长限制，有望建立一种准确、简单、适应性广的常规PCR产物单倍型分析方法，为生命科学相关的基础研究以及可能的临床疾病诊断提供实验手段。关键词：单倍型；限制引物合成；等位基因特异性引物；ddNTP封闭引物IIAbstractAbstractTitle:Haplotype-containedPCRproduc