引物设计-RT-PCR 和CDS引物设计.pdf

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1、引物设计1RT-PCR引物设计2CDS引物设计超螺旋科研群307280677微信号：wg1985316RT-PCR引物设计方法一：直接打开https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/（图1）图1在searchby寻找基因的名字号物种部分选择需要的类别（目前只有，人和小鼠）下面输入基因的名字，例如sox2RT-PCR引物设计然后选择片段大小在80-150bp之间的序列如下：然后去NCBI-Primerblast一下：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast

2、/双向验证，引物好用设计专属自己的引物打开NCBIhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=sox2选择物种第二步，点击SOX2，选择NM-003106.3，然后打开，点击FASAT:如下图将序列复制粘贴到word，用UCSC，区分不同的外显子：打开这个网站，点击blat输入刚才的全部复制的碱基出现下面这样的图很抱歉，这个只有一个外显子很多外显子的话，一个个在word标注出来，截取一段夸两个外显子的序列就可以选择一段序列，放入在线的primer3http://www.simgene.com/Primer

3、3http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/上面两个都都可以最后用NCBI-PRIMER-BLAST验证一下就可以CDS扩增引物设计1:打开NCBI,选择GENE,输入基因的名字如SOX2选择人的物种选择CCDS3239.1，然后点击：讲序列放到word,把序列放到NEBCUTTERhttp://tools.neb.com/打开第一个，放入序列：选择OCUTTER，代表这个酶切位点可以用，选择和载体中能够用的酶切位点载体信息可以用的酶切位点已经标注出来，优先选择ECORI,Bamh1，这两个酶比较便宜这两个酶切

4、位点可以用SOX2-cds-F:保护碱基+酶切位点+ATG开头的20个碱基SOX2-cds-R:保护碱基+酶切位点+3段最后的20bp的反向互补碱基保护碱基的选择根据酶切位点来的，实际上任意添加影响也不大SOX2-cds-FAAGAATTCATGTACAACATGATGGAGAAGGATCCTCACATGTGTGAGAGGGhttp://www.91bio.com/SMS2/rev_comp.html反补序列用这个软件引物质量评价软件：http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc

5、.html备注：真核细胞表达需要考虑要不要加帽子问题谢谢大家