引物设计大全.pdf

《引物设计大全.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、引物设计和Primer-BLAST的应用LvPeng2015.11.18CONTENT1.PCR-引物设计目的2.引物设计原则3.设计引物软件4.在线设计工具5.probeBase简介1.1PCR（PolymeraseChainReaction）聚合酶链式反应1986年5月19711985KhoranaKaryMullisMullis在冷泉港实验室提出设想发明了PCR做专题报告冷泉港实验室（TheColdSpringHarborLaboratory，缩写CSHL），又译为科尔德斯普林实验室。几不同的PCR技术1.扩

2、增已知序列两侧DNA的PCR：反向PCR（InversePCR，IPCR）、锚定PCR（anchoredPCR）、RACE（RapidAmplificationofcDNAEnds）、连接介导的PCR（ligation-mediatedPCR，LM-PCR）；2.检测有限量稀有靶序列，即一对引物扩增产物不足以以通过凝胶电泳观察到的时：巢式PCR（nestedPCR）；3.快速、灵敏、特异而准确定量的PCR：实时荧光定量PCR（real-timequantitativePCR，RQ-PCR）。1.2引物设计原则引物特

3、性及优化设计特性优化碱基组成（G+C）含量应在40%-60%，4种碱基要分布均匀；长度一般为18-27个核苷酸长度。上下游引物长度差别不能大于3bp；重复和自身互补序列不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列存在；上下游引物互补性一个引物的3’末端序列不能结合到另一个引物的任何位点上；解链温度（Tm）两个引物的Tm值相差不能大于5℃，扩增产物与引物的Tm值相差不能大于10℃3’末端引物3’末端碱基尽量为G或C，不能使3’末端有NNGC或NNCG序列引物序列不要有局部的GCrich或ATrich（特别是3’端），

4、避开T/C或A/G的连续结构1.3常用引物设计软件PrimerPremier6（P6）、BeaconDesigner8（DB）（自动搜索）Oligo6（引物评价）VectorNTISuit（综合分析）PrimerExpress（实时定量PCR引物和探针设计）*Omiga*Dnastar1.3.1Primer6和BD8设计引物参数•斑马鱼基因serpine1：抑制血管生成和新陈代谢•NCBIReferenceSequence:NM_001114559.1PrimerPremier6(PP6)参数Tm：57℃+2℃Le

5、ngth：18+27bpAmpliconLength：80—200bp(G+C)%=40%—60%BeaconDesigner8(BD8)参数Tm：66℃+2℃Length：18+27bpAmpliconLength：80—200bp(G+C)%=40%—60%1.3.2BeaconDesigner8（BD主界面）功能选择区设计结构选项序列基本信息序列碱基详细信息窗口其他信息引物特征所有引物和结构选择引物显示区1.3.3BD8操作流程（1）序列导入（2）参数选择（3）结果分析（4）引物检验序列名称序列长度1789m

6、RNA碱基序列1.3.3BD8操作流程（1）序列导入（2）参数选择（3）结果分析（4）引物检验ΔG值：DNA双链形成时所需的自由能，反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应选择3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值过高，引物Tm值容易在错配位点形成双链结构并引发DNA引物长度聚合反应。（能值越高越容易结合）GC含量产物片段长度基本参数高级参数1.3.3BD8操作流程（1）序列导入（2）参数选择（3）结果分析（4）引物检验外显子信息得分长度Tm值GC%1.3.3BD8操作流程（1）序列导入（2）参数

7、选择（3）结果分析（4）引物检验所有引物引物二级结构同向引物二聚体引发夹结构物得分交叉二聚体降序连续序列“—AA—”重复序列“—GCGC—”FP：AGTGAAGATGGAGTGGAGGTAGRP：TCTGGCTGGCTGAAGTCTATC1.4常用在线设计引物工具•http://www.idtdna.com/site（IntegratedDNATechnologies）•WebPrimer：http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer（酵母基因组数据库提供）•Prime

8、rDesign：http://bioweb.uwlax.edu/GenWeb/Molecular/seq_anal/primer_design/primer_design.htm（较基础全面）•NCBIPrimer-Blasthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/（引物设计、验证）1.4.1NCBIPr