微生物实验操作基础 灭菌及无菌操作.doc

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1、实验十二微生物实验操作基础菌及无菌操作一、目的要求学习灭菌的方式方法，区别儿种灭菌方式的相同点和不同点。掌握实验室无菌操作的操作方法和注意事项，体会无菌操作技术在微牛•物研究中的重要性。二、知识介绍灭菌技术sterilization为什么耍灭菌？（杂菌污染的后果）I.営养基质或产物被消耗损失；2.抑制生产菌的生长；3.抑制产物的生物合成；4•杂菌繁殖导致培养液性质（如pH）改变，造成生物反应异常。灭菌原理与施灭菌（sterilization）思轲闻物H或（霍纺去杀灿却辙料或设备屮所^微1羽耐j沐或工艺过程。灭菌方法有化学物质灭菌、辐射灭菌、过滤介质除菌和热灭菌等。（一）、化学物质灭菌通过改

2、变微生物细胞膜的渗透性，或者损伤细胞膜，影响微生物细胞的正常代谢。不适合丁•培养基的灭菌，只适合丁•局部空间或某些器械的消毒。1・无机酸、碱及盐类酸碱的杀菌能力主要由其电离度而定，电离出得氢离子或氢氧根离子浓度越高,杀菌力越强。盐溶液的杀菌力与其浓度成正比。（腌咸菜可以保藏很长时间而不染菌）2.重金属盐杀菌原理是重金属盐使细胞中蛋门质失活。比如升汞。服食牛奶、鸡蛋等高蛋白含量食物可解再C2.氧化剂高猛酸钾4.有机化合物乙醇：脱水、使蛋白质变性和沉淀，70〜75%財效（二）、辐射灭菌1•酗线诱导胸腺甑二聚本的形成从耐脚了DNA的gM勒在紫夕倾射卜产生臭氧，臭氧也具有一定的杀菌作用。2.X射线

3、、Y射线：能量极高，被菌体吸收后，菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反覘形成OH-.过氧化氢和有机过氧化物，这些过氧化物阻碍微生物的代谢活动而导致菌体死亡。（三）、过滤介质除菌工业上利用过滤的方法制备大量的无菌空气，供好氧微牛物的深层培养使用o（卩4）、干热灭菌1.火焰灼烧法2.十热空气灭菌法：140〜160C维持2〜3h。（五）、湿热灭菌湿热灭菌条件为12]°C维持20〜30min。巴氏杀菌（Pasteurization）低温消毒法,主耍丿'V用丁生产酸奶^制品。冃前国际JL通用的巴氏高温消毒法主耍有两种：种是将牛奶加热到62-65°C,保持刚冷中°采用这_•方法，可杀死牛奶中各种生长型

4、致病菌，灭菌效率可达97.3%〜99.9%,纟彳消繭護留的只是部分嗜热SK耐热性菌以及芽电等,仮这些细菌多数是乳酸菌，乳酸菌不但对人无害反而有益健康。第二种方法将牛奶加热至】]75〜90°C倔5〜16秒？餾时取曲TWmiWW的基本原则是，能将病原菌杀死即可，温度太高反而会有较多的营养损失。无菌操作（一）基本原理高two沁亍，用以达到灭菌的冃的。自然界中各种微生物混杂生活在一•起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分离法常用的有:稀释涂布平板法

5、、稀释混合平板法与平板划线法。丕同的微生物在固体、半固体和液体培养基中能表现出各口特有的培养特征，这些特征可以作为不同种类微生物的鉴别特征z—。（二）、讲授重点1•倒平板：灭菌的培养基冷却到55°C左右,摇匀。解开麻绳，去掉三角瓶口上盖，右手持装培养基的三角瓶在酒灯旁，瓶口对着火焰。左手带cm无菌培养川I•并将川L盖在火焰旁打开一条缝，迅速倒入培养基约15ml,加盖后轻4豳动培养皿，平置于桌而上使1•繇基均匀分布于皿底，待冷凝后即为平板。1.平板命去和涂布平板法三、实验操作步骤灭菌：高温蒸汽灭菌锅20MIN,120°C标记：用记号笔对待接试管斜而培养基进行标记写上待接菌种名称、接种H期、组

6、别。稀释菌：酒精灯附近进行混合菌液和熔化冷却至培养50-60°C（于触可接受温度）以下的培养基倒平板培养：平板倒置培养基面在上放37£培粥®中培养24-36小时。四、实验过程中的注意事项1.无菌接种技术雑拠畑遊亍;以^;接M渊环您碰侦如边,防止污染；塞盖不可放在桌面上，应该用右手手缘或右手指间夹住，或玻璃盖放后火焰灭菌盖上。操作台及不可高温蒸汽灭菌物品使用前和使用后用75%酒精消毒。2平板分离扌妳倒平板时，培养皿边缘不要沾染培养基，摇匀培养基时要轻，以防培养液溅到皿盖或溢出培养叫平板培养微牛物时…定要倒蜀培养。七、实验结果1・记录液体培养基和固体斜而培养基上，细菌的生长状况。2・记录菌种分

7、离培养的结果。八、实验操作考核点1・无菌操作2・平板划线方法是否正确