实验五、无菌操作及接种技术

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1、实验七无菌操作及接种技术一、微生物接种技术一）、实验目的学习微生物接种工具的使用，掌握无菌操作方法，建立有菌概念。二）、实验原理无菌技术：指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程。三）实验用品四）实验步骤：1、接种工具的介绍接种环、接种钩、接种针、接种圈、接种锄、玻璃涂棒、其他接种工具2、超净工作台超净工作台是为实验室工作提供无菌操作环境的设施，以保护实验免受外部环境的影响，同时为外部环境提供某些程度的保护以防污染并保护操作者。原理：超净工作台的洁

2、净环境是在特定的空间内，洁净空气(进滤空气)按设定的方向流动而形成的。以气流方向来分，现有的超净工作台可分为垂直式，由内向外式以及侧向式。垂直流超净工作台水平流超净工作台垂直流超净工作台超净台的使用与维护风速保持在0.32-0.48米/秒使用前打开紫外灯照射40~60min开启超净工作台工作电源，关闭紫外灯，并用75%的酒精或0.5%过氧乙酸喷洒擦拭消毒工作台面。使用中，有机玻璃罩受到污染，严禁用酒精棉球擦拭，请用含水棉布檫拭；请保持超净台整洁、干燥，不要堆积杂物；使用完毕，关闭煤气开关或酒精灯；使用完毕后，用消毒液擦拭工作台面，关闭工作电源，重新开启紫外

3、灯照射15min.定期做无菌试验，以测定净化台是否符合无菌要求。2、无菌操作要点1）、要求建立“有菌概念”。2）、接种时要有一个洁净的环境，整个操作过程必须在火焰旁进行。3）接种环，棉塞一定要拿在手上，不能随便乱丢。3、微生物接种技术1）、斜面接种技术从斜面菌种将菌移接至另一斜面培养基的方法，叫做斜面接种。接种方法：A、接种前用酒精棉球擦净桌面；B、将试管贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等，然后用酒精棉球擦手消毒；C、点燃酒精灯以后，在火焰旁将每一支试管内的棉塞稍微转一下，使其松动，以便在接种时易拔出，并将试管放在试管架上，放在接种台的右前方；D、

4、将菌种和斜面培养基的两支试管，用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于两试管之间的部分，斜向上，并使他们呈水平位置，也可将试管横放在左手掌中央，用四个手指托住试管，大拇指压在试管上，斜面向上；E、右手拿接种环，在火焰上将环的部分烧红灭菌，环以上凡在接种可能进入试管内的部分，均应通过火焰灼烧。（见图4）图4接种环灭菌以下操作，需要使管口靠近火旁F、用右手小指、无名指和手掌拔掉棉塞；G、以火焰灼烧管口，灼烧时应不断转动试管口，使试管口沾染的少量菌得以烧死；H、将烧过的接种环伸入菌种试管内，先将环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烧死被接种的菌体，然后轻轻

5、接触菌体，取出少许，慢慢将接种环抽出试管（图5），注意尽量不要使环的部分碰钉子到管壁，取出后不可使环通过火焰；图5从一个试管移种到另一试管I、迅速将接种环在火焰旁伸进另一试管，在斜面培养基上从底部划线到顶部，但不要把培养基划破，也不要使菌种沾染管壁；J、取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上，不要用试管去迎棉塞，以免试管在运到时灌入不洁的空气，K、将接种环在火焰上再灼烧灭菌，放回原出后，再腾出手来将棉塞塞紧，将新接种的斜面试管放在试管架上；L、接种后的斜面培养基，放在恒温箱内培养。斜面接种示意图A、加热融化培养基将三角瓶瓶口包扎绳解开，轻轻旋动棉塞，

6、然后将瓶子放入微波炉中加热，选取高火力，加热1min后取出晃动，反复加热直至培养基完全溶解。B、倒平板右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边，用左手将瓶塞轻轻地拨出，瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。2）、平板接种技术接种方法：A右手持接种环，经火焰灭菌，待凉后，挑取培养物少许。左手斜持琼脂平板，皿盖留在桌上，于火焰近处将菌涂于琼脂平板上端，来回划线，涂成薄膜（约占平板总表面积的1/10），划线时接种环与平板表面成30~40

7、º角，轻轻接触，以腕力在平板表面行轻快地滑移动作，接种环不应划破培养基表面。B、烧灼接种环，杀灭环上残留细菌，待冷（是否冷却，可先在培养基边缘处试触，若琼脂溶化，表示未凉，稍等再试），从薄膜处取菌作连续平行划线，约占平板表面1/5左右，再次烧灼接种环，等三次平行划线……以同样方法作第四次，第五次划线，将平板表面划完。C、划线完毕，盖上平皿盖，底面向上，用标签或腊笔注明菌名检验号码，接种者信息等，置37℃孵育培养24小时后观察结果。※划线接种目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌、活菌计数。方法：★分区划线法：适用于含菌量较多的标本★连

8、续划线法：适用于含菌量较少的标本※划线接种分区划线法第一区划线灭菌