毒死蜱降解菌的筛选鉴定.doc

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1、第4章毒死脾降解菌的筛选鉴定4.1毒死蝉简介毒死脾(chlorpyrifos),有效成分的化学名称为0,0■二乙基-0-(3,5,6-三氯毗喘基)硫逐磷酸酯，是美国陶氏化学公司(DowChemicalCo.)于1965年开发并研制出来的一种广谱性有机磷酸酯类杀虫剂，作为卫生杀山剂，可以用来防治白蚁、虱子、跳蚤和蝉螂等多种卫生害虫［83］；作为农用杀虫剂，可有效防治水稻、苹果、蔬菜等丄的盼虫、嘀类、小菜蛾等百余种害虫［841o值得注意的是，毒死脾潜在危险性不容忽视，对鱼类及水生生物毒性较高［85］

2、,对蚯蚓不安全，能够明显加重蚯蚓的死亡率［86］o2000年6月8H美国环境保护局官员Browner指出,毒死蝉杀虫剂对人的神经系统和脑发育可能会有潜在影响，对儿童健康有害［87］。许多国家对农产品，特别是蔬菜丄的毒死脾残留量进行了严格的规定。在对外贸易小农药残留检测项H屮也包括毒死蝉。因此，毒死蝉的残留问题H益受到重视。4.1.1高效降解菌株的筛选4丄1・1微生物的获取途径H前，可降解农药的微生物的获得途径主耍有：从受农药污染严重的土壤屮筛选分离具优良性状的菌种；定向培育优良菌种；在此基础上，

3、进行诱变育种及构建工程菌。从受农药污染严重的土壤屮筛选分离具优良性状的菌种是H前采用最多的一种方法，一般是利用农药排污口及周围或长期使用某一种农药的土壤，经富集培养，分离出可降解农药的高效菌株。定向培育优良菌种近年来也受到人们的关注，其方法就是在土壤川通过人为多次施药，培育可降解该农药的微生物，半再次施药时，经降解速率的测定，如发现农药在该土壤屮的降解速度快于未施药土壤，则可确定可降解该种农药的微生物种群己被培育起来，而后从屮分离出高效菌株。这方而的研究已有过成功的例子,如Alian等通过向土壤

4、施用蔡内酸草胺诱发该农药降解菌的产生并分离。Ronald等连续向土壤施用乙烯菌核利，诱发筛选出该农药的降解菌假单抱杆菌。在上述农药降解菌的培育过程屮，诱变育种也是常用的方法。王永杰等通过紫外诱变育种获得高效菌株，刘玉焕等用NTG诱变曲霉属乐果降解菌，用该菌处理乐果1小时后，乐果降解率由原来的56%提高到87%o4.1.1.2微生物菌种的筛选步骤在自然界，微生物是以混杂的形式群居于一起的，菌株筛选是以纯种培养为基础的，要根据菌种的特性、嗜好、形态丄的差异，运用灵活的手段才能将所需要的微生物分离出来

5、，一般的筛选步骤是：采样、富集培养、纯种分离、筛选、鉴定。(1)采样为获取降解农药的微生物菌株，可从现己收藏的菌种小筛选，亦可以从土壤、水体或污染环境屮采样经直接分离筛选或经富集培养获得。土壤长期使用某一•农药使得该农药降解菌逐渐富集，以后施入该农药时，其分解速率大大加快，这也是一些除草剂连续施用后效果下降的原因，如直接分离得不到H的微生物，可能是该微生物在试样屮不存在或含量太少，遇到这种情况也可采用富集培养。（2）富集培养采来的样品屮往往是我们想要的菌类含量不大，血另一些微生物却大量存在，为了

6、容易分离到所需要的菌种，血让无关的微生物至少是数量上不要增加，可以选择性地配置培养基，选择一定的排样条件来控制，例如碳源的控制等。农药降解菌的富集培养方法主要有：液体培养法、土壤环流法、连续流动培养法。通常是从长期被某种药剂污染的土壤和污水屮取样经富集培养，再经固体培养分离纯化得到所需菌株。根据Veldkamp的研究，富集培养可分为封闭式和开放式（即连续培养）两种类型。恒化器作为连续培养是一种有效方法，以H标农药作为培养屮的生长限制底物，在这种选择原则的作用下，可筛选到降解H标农药的微生物菌株或

7、诱发出有降解能力的突变菌株。由于农药具有成本低、见效快、省吋省力等优点，在世界各国的农业生产屮被广泛生产使用，仅同吋借助恒化器也可进行分子育种，如Kelloge曾在恒化器屮接入各种有关农药降解的质粒菌，逐渐增加2,4,5・T的浓度进行诱导，结果培养出能降解除草剂2,4,5-T的工程菌,使难以被微生物降解的高残留除草剂有了“克星”。可见富集培养对农药降解菌的分离筛选起着重要作用[35]o（3）菌株的分离和筛选农药降解微生物的分离、筛选是根据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性，对营养物可利用性比较

8、广泛的特性，在选择性培养基屮加入某些特殊碳源为营养物质，使样品屮少数能分解利用此类物质的微生物大量繁殖，并将其分离出来的方法。纯种分离的方法一•般采用混合平板分离法、平板划线分离法、涂抹法或稀释分离法。要根据各类微生物生长所需要的营养和环境条件不同血人为地加以控制，有利于某种微生物在培养基上出现典型单个菌落。4.2实验部分4.2.1材料及仪器4.2.1.1菌种来源菌种来自巢湖某农药厂排污沟污泥，取回后用保鲜袋带回，并在4°C下保存。4.2.1.2标准试剂与药品二氯甲烷（Dichlorometha