疫苗生产实验方法.pdf

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1、实验一生产用毒种制备一、实验目的1.掌握血凝（HA）实验的原理。2.掌握病毒HA效价测定方法。3.熟悉无菌操作采集尿囊液方法3.了解常用的生产用毒种的制备方法。二、实验用品1.器具：照蛋器、鸡胚孵化箱、超净台、注射器、EP管、微量移液器、枪头、小烧杯、离心机、离心管、培养皿、96孔反应板、恒温箱等。2.试剂：生理盐水、1%鸡红细胞悬液。3.实验材料：9日龄鸡胚、未免疫过的鸡、新城疫种毒三、实验内容1.参加实验的学生领取鸡胚，做好标记。2.教师讲解实验过程及步骤并演示具体的实验操作技术。(1)病毒增殖将已分装的种毒用生理盐水作10-3倍稀释，尿囊腔接种10日

2、龄鸡胚，每胚0.lmL。(2)收集病毒病毒接种后24h，48h，96h分别来检验并记录活死胚情况于表1中，并及时弃去腐败胚。无菌操作方法釆集48-96h死亡胚及96h活胚的尿囊液，收获前先将鸡胚置于4℃冷冻6-18小时，冷冻后的鸡胚钝端向上，将气室上方卵室用碘伏消毒除去，暴露壳膜，用无菌镊子小心将壳膜从绒毛尿囊膜上撕下，不要损伤绒毛尿囊膜。用注射器刺入尿囊腔，吸取尿囊液，置低温保存。可将若干胚液混合后测定血凝实验（HA）效价。(3)HA效价测定用微量移液器向96孔反应板的第1-12孔各加生理盐水50uL。用灭菌的生理盐水将收集的鸡新城疫抗原50uL加入第一

3、孔中，反复吹打4-5次后，吸出50uL到第二孔，依次倍比稀释到第11孔，弃去50uL，病毒稀释倍数依次为1:2-1:2048，第12孔不加抗原作为红细胞对照。用微量移液管向1-12个加1%的鸡红细胞悬液50uL。置于微量振荡器上，振荡1-2分钟，室温静置15-20分钟后观察结果，记录于表2中。结果判定：将反应板倾斜为45度角，沉于管底的红细胞沿着斜面向下呈线状流动者，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集，如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能使100%红细胞凝集的病毒液的最高稀释倍数，称为该病毒液的红细胞凝集（H

4、A）效价。效价为使鸡红细胞完全凝集的病毒最大稀释倍数，为该病毒HA效价，HA效价用被检血清的稀释倍数或以2为底的对数(log2)表示。HA效价在9(log2)以上者可用作制苗抗原。将合格的尿囊液保存于-20℃--30℃冰柜中待用。3.学生根据实验步骤进行实验操作。表1接种病毒后鸡胚的存活情况结果接种后时胚胎总活胚数死胚数死亡率间数表2血凝实验(HA)观察结果孔123456789101112号注：＃表示100%完全凝集，＋＋表示50%凝集，－表示不凝集四、注意事项1.制作1%红细胞悬液所采用的鸡，应为未接种过新城疫疫苗的健康鸡，有抗体的鸡提供的红细胞需要更多

5、次数洗涤。2.每加一种样品都要换一个移液器的枪头，以免影响实验结果。3.1%红细胞悬液4℃保存，使用时轻轻摇匀，做同一次实验或测同一批样品不能更换红细胞，正常保存3天的红细胞不影响实验结果。4.温度对实验结果有影响，当温度低于4℃时，红细胞有时会发生自凝现象。5.96孔反应板是否干净，光滑会影响实验结果。五、思考题1.如何进行禽流感H5，H9的抗体的测定？2.如何确定新城疫病毒的HA效价？实验二制苗材料鸡胚的接种方法一、实验目的1.掌握鸡胚尿囊腔的接种方法。2.了解鸡胚的结构与生理。3.了解鸡胚的各种接种方法。二、实验用品1.器具：照蛋器、鸡胚孵化箱、超净

6、台、注射器等。2.试剂：生理盐水、碘伏、75%酒精、液体石蜡。白蜡烛等。3.实验材料：9日龄鸡胚。三、实验内容1.参加实验的学生领取鸡胚，做好标记。2.教师讲解实验过程及步骤并演示具体的实验操作技术。(1)活胚检查血管检查：活胚可见清晰的血管，有时可见血管搏动，死胚血管模糊成淤血带或淤血块。胎动：活胚可见明显的自然运动，尤其在转动胚胎时，死胚见不到任何胎动，胚胎发红像出血样，有的呈现黑块。血管网是否丰满：发育好的鸡胚可见密布丰满的血管网，也就是绒毛尿囊膜，死胚则无此现象。(2)鸡胚主要结构的标注选照检后合格的活胚，在照蛋器的协助下，标出气室边界和胚胎位置，

7、用铅笔画出鸡胚周围的主要血管，在胚胎面气室上方靠近边界2-3mm处，避开血管做一标记，即为注射点。(3)接种用碘伏消毒标记处的卵壳，在标记处用镊子钻一孔，再次用碘伏消毒钻孔区，将注射器针头经孔刺入尿囊腔，注入0.1-0.2mL生理盐水，将白蜡熔化封孔，33-35℃孵育48-72小时，每日照检，24小时内死亡的为接种失败胚胎。3.学生根据实验步骤进行实验操作。四、注意事项1.在整个接种操作过程中，要保持无菌化操作。2.白蜡封孔时，注意封闭是否完全，以防细菌进入，导致鸡胚感染，死亡。五、思考题1.为何要在接种前进行鸡胚主要结构标注？2.鸡胚接种病毒时后，于33

8、-35℃孵育48-72小时，每日照检，为何要弃去24小时内死亡胚胎