蛇足石杉内生真菌Shiraia sp.Slf14中LDC和CAO基因的克隆及表达.pdf

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4、谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解江西师范大学研究生院有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权江西师范大学研究生院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签

5、名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月摘要石杉碱甲（HuperzineA,HupA）是治疗阿尔茨海默症的生物碱类药物。由于化学合成、石松属植物栽培及细胞培养等生产技术无法突破，HupA仅能从野生蛇足石杉等石松属植物中提取，存在原料短缺和环境破坏等严重问题，内生真菌发酵生产HupA成为可供选择的替代方式。生物合成途径的阐明是采用基因组学、代谢工程、组合生物合成等现代生物技术生产代谢产物的基础，但HupA等石松生物碱生物合成途径尚未阐明。本研究以高产HupA的蛇足石杉内生真菌Shiraiasp.Slf14为对象，对全基因组测序和生物信息学分析预测的编码石杉碱甲生物合成中第一、

6、二步反应的关键酶—赖氨酸脱羧酶（Lysinedecarboxylase,LDC）和铜胺氧化酶（copperamineoxidase,CAO）基因，开展其体外功能分析。根据全基因组序列信息获得的LDC序列信息，本研究采用RT-PCR技术，从Shiraiasp.Slf14中扩增得到长度为687bp的LDC基因(GenBankID:KT362170)，并成功构建大肠杆菌表达质粒pET-22b-LDC与pET-32a-LDC，转化感受态细胞E.coliBL21(DE3)，诱导表达出重组蛋白LDC与Trx-LDC。经SDS-PAGE电泳鉴定分子量分别约24kDa和42kDa，与预计大小相

7、符。通过2+Ni金属亲和层析纯化重组LDC与Trx-LDC并建立酶促反应体系，利用TLC检测LDC催化活性，结果表明LDC与Trx-LDC均具有赖氨酸脱羧酶活性。利用生物信息学软件分析了LDC的理化性质及蛋白质的空间结构：二级结构显示出α螺旋占37.3%，β折叠占11.4%，无规则卷曲为51.3%；从三维结构看出LDC为二聚体结构，N端肽链暴露在蛋白表面，主要通过C端肽链相互作用形成二聚体。基于赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列系统进化树分析可知，Shiraiasp.Slf14的LDC与来源于Aspe