绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达分子实验设计.doc

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1、绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达张历涵2013141241098彭千2013141241068一、质粒转化入感受态细胞并培养1、原理实验室提供的质粒首先要转入大肠杆菌进行培养与增殖，制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的D

2、NA分子的受体位点等。本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。2、实验步骤2.1DH-5α和BL-21感受态细胞的制备（1）将0~4℃保存的DH-5α和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37℃下250r/min过夜培养16h。（2）将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2mL的LB液体培养基中，37℃活化培养2～3h至OD=0.3～0.5。（3）取1.5mL菌液转入EP管中，置于冰上10min,然后于4℃下5000r/min离心5min。弃上清液，沉淀加入0.1mL预冷

3、的0.1mol/LCaCl2缓和悬菌。冰上放置15-30min后，4℃下5000r/min离心10min。（4）弃上清液，沉淀用0.1mL预冷的0.1mol/LCaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在－20℃冰箱内保存。2.2感受态细胞的转化（1）取制备好的感受态细胞100μl，冰上解冻，均匀悬浮。（2）加入2μl酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30min。（3）42℃水浴中热击70sec后，冰上放置2min。（4）加入200μlLB液体培养基，37℃，50-100rpm振荡培养1h。（5）取200μl悬浮细胞涂布在含合适抗生素的L

4、B固体培养基上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2h后，封口膜封好平皿，37℃培养倒置12-16h。二、质粒的提取和琼脂糖凝胶电泳检测1、原理：首先选择好将绿色荧光蛋白导入大肠杆菌的载体，一般选用pET-28a质粒，因为该质粒具有多酶切割位点，并且导入外源基因后可以充分表达。已知pEGFP-N3质粒上携带表达绿色荧光蛋白的基因，此基因作为目的基因pET-28a质粒作为载体进行重组前需要先提取并检测。使用碱裂解法提取质粒，用到3种溶液，溶液I：50 mM葡萄糖、 25 mM Tris-Cl 、 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液

5、II：0.2 N NaOH、1% SDS；溶液III ：3 M 醋酸钾、 2 M 醋酸。选用适当浓度和适当pH值的Tris-Cl溶液来调节溶液ph。加入的葡萄糖可以使悬浮后的菌不会快速沉积到管子底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制DNase的活性和微生物生长。此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。溶液II中NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，会使细胞膜从双层膜向微囊结构的相变化，SDS为下一步做铺垫。溶液III的作用SDS在高盐浓度下发生沉淀，同时SDS能与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合

6、一个SDS分子，所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。溶液中的K+置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，高浓度的盐使沉淀更完全。同时，由于基因组DNA很长，容易被PDS共沉淀。2M的醋酸可以中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。基因组DNA一旦发生断裂，小于100kb的片断，就不容易与PDS共沉淀。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量的基因组DNA污染。这一步操作混合均匀后在冰上放置，可以使PDS沉淀更充分。在pH为8.0-8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带

7、负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的琼脂糖凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛作用下，事分子大小和构象不同的核酸分子涌动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如溴化乙锭）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA、闭环超螺旋DNA。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋＞线状＞开环。1、实验步骤2.1将目的基因质粒的大菌种接种在液体培养基中（相应浓度抗生素），37℃培养过夜。2.2收集菌体将扩增

8、的菌体收集1.5mlEP.管中。每次4℃，12000r/min离心2min，弃上清液后重复一次，弃上清液。2.3裂解菌体（1）将菌体沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡10min.（2）加200μl新配制的溶