苯酚生物合成工程菌株的代谢工程.pdf

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3、ｉ’蔡％惡？ｖ＾，声系壤又Ｖｔ＞．爹隻一）；＇巧乾Ｉ．ｌ議議摘要摘要苯酚是一种基本有机化工原料，主要用于生产某些树脂、双酚A、己二酸及药物等，因此苯酚生产具有良好的发展前景，苯酚的化学合成虽具有较多优势但仍存在生产成本高、环境污染大、副产物多等一系列问题。甘油资源丰富、价格低廉，由于其C原子的高度还原性，在燃料和化学品生产中具有比普通糖如葡萄糖等更高的收益。本文从上述两个方面考虑，探索一条利用甘油为原料，在大肠杆菌中构建苯酚的发酵生产途径，研究结果如下：（1）TPL（编码酪氨酸苯酚裂解酶）

4、基因密码子优化及酶活测定。将来源于Enterobacteragglomerans的TPL野生型基因的密码子替换为大肠杆菌偏好的密码子优化序列，重组菌EscherichiacoliBL21（pET28a-TPL）经蛋白表达可催化10mM底物酪氨酸生成5.66mM苯酚，TPL酶活力得到验证。（2）利用甘油生产苯酚代谢途径的打通。该途径涉及到两个关键酶，即TPL和P4M（编码苯丙氨酸-4-单加氧酶），苯丙氨酸在苯丙氨酸-4-单加氧酶催化下生成酪氨酸，然后在酪氨酸苯酚裂解酶催化下生成苯酚。构建了重组大肠杆菌EscherichiacoliATCC3188

5、4（pTrc99a-TPL-P4M），命名为PH1，利用甘油发酵测得苯酚的生成，产量为21.30mg/L。（3）甘油利用基因表达水平的增强。甘油的利用涉及到两个酶，即果糖-1,6-二磷酸酶（GlpX）和转酮醇酶（TktA）。构建重组大肠杆菌EscherichiacoliATCC31884（pTrc99a-TPL-P4M-trcGlpX-TktA），命名为菌株PH2，利用甘油发酵测得苯酚的生成，产量为27.68mg/L。经发酵检测后结果分析P4M为限速酶，因此又构建重组大肠杆菌EscherichiacoliATCC31884（pTrc99a-TP

6、L-trcP4M-trcGlpX-TktA），命名为菌株PH3，利用甘油发酵测得苯酚产量为57.66mg/L。（4）增加莽草酸途经中前体磷酸烯醇式丙酮酸的供应。采用Red同源重组技术首先敲除基因pykF（编码丙酮酸激酶），其次敲除基因ptsI（编码蛋白磷酸转移酶）和基因ppc（编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶），质粒pTrc99a-TPL-trcP4M-trcGlpX-TktA分别电转化基因敲除后的3株重组菌株，得到菌株PH4、PH5、PH6，利用甘油发酵测得苯酚产量分别为88.38mg/L、123.85mg/L和127.60mg/L。（5）发酵优化

7、。为提高苯酚产量，对发酵培养基进行优化，并采用双液相发酵法减少苯酚对菌株的毒害。选取5种有机溶剂：正辛醇、三丁酸甘油酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二辛酯、肉豆蔻酸异丙酯，加入到菌株PH6发酵液中进行发酵，测得苯酚产量分别为4.31mg/L、143.10mg/L、95.27mg/L、159.01mg/L、116.63mg/L，其中邻苯二甲酸二辛酯对于提高苯酚产量最为有利。最后，本研究利用甘油生产苯酚的最高产量达159.01mg/L。关键词：苯酚；甘油；酶活测定；基因敲除；双液相发酵IAbstractAbstractPhenolwasanimpo

8、rtantchemicalmaterialandmainlyusedfortheproductionofsomeresins,bisphenolA,a