植物组织培养步骤.doc

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1、植物组织培养概念（广义）又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞,原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。植物组织培养概念（狭义）指用植物各部分组织，如形成层•薄壁组织•叶肉组织•胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程屮从齐器官上产生愈伤组织的培养,愈伤组织再经过再分化形成再生植物。组织培养的步骤一、培养基配制配制培养基有两种方法可以选择，一是购买培养基屮所有化学药品,按照需要自己配制；二是购买商品的混合好的培养基基本成分粉

2、剂，如MS、B5等。自己配制可以节约费用，但浪费吋间、人力、且有时由于药品的质量问题，给实验带来麻烦。就H前国内的情况看，大部分还是自己配制。为了方便起见，现以MS培养基为例介绍配置培养基的主要过程。1、配制几种母液（1）配制MS大量元素母液一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。分别称取NH4N03165gKH2P0417gKNO3190gCaC12•2H2O44gMgS04•7H2037g各自配成IL的母液。倒入IL试剂瓶中，存放于冰箱中。（2）配制MS微量元素母液一般将微量元素

3、配制成100倍母液。依次称取KI0.083gNa2Mo04•2H200.025gH3B030.62gCuS04•5H200.0025gMnS04•H201.69gCoC12•6H200.0025gZnS04•7H200.86g配成IL母液，倒入IL试剂瓶中，存放于冰箱中。CuS04-5H20和CoC12・6H20由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。分别称取CuS04•5H2O0.05gCoC12•6H200.05g各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。（

4、3）配制MS有机母液一般配制成100倍MS有机母液。依次称取肌醇10g盐酸硫胺素（VB1）O.Olg烟酸0.05g甘氨酸0.2g盐酸毗哆醇（VB6）0.05g配成1L母液,倒入1L试剂瓶中,存放于冰箱中。（4）配制MS铁盐母液一般配制成100倍MS铁盐母液。依次称取EDTA二钠3.73gFeS04・7H2O2.78g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。所以MS母液有5种大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有机母液和MS铁盐母液，共8种母液。激素母液的配制各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合

5、在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1半量的盐酸溶解，然后再加蒸饰水定容。一般取lOOmg配成100ml母液。2、配制培养基以配置ILMS培养基为例，按顺序进行如下操作：（1）先在烧杯中放入一些蒸饰水。（2）分别取上面八种母液10ml倒入。（3）一般称取30&蔗糖倒入，搅拌溶解。（4）加蒸饰水用量筒定溶至lLo（5）按设计好的方案添加各种激素，由于激素的用量很小，而且激素对组培植物的生长至关重要。所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取,减少误差。（6）用精密试

6、纸或酸度计调整PH至5.7-5.8o（有条件的话使用酸度计，比较精确）可配1当量的HCL和1当量的NaOH用来调溶液PH值。1当量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。1当量NaOH配制：称取NaOH4g配成100ml溶液。（7）称取5g左右琼脂粉（质量好的琼脂粉），倒入上而配好的溶液小，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化。（8）稍微冷却后，分装入培养容器屮。无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口，用橡皮筋或绳子扎紧。（9）放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右。（10）灭菌后从灭菌锅屮取出培养基

7、，平放在实验台上令其冷却凝固。二.灭菌灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是：凡是暴露在空气屮的物体，接触H然水源的物体，至少它的农而都是有菌的。依此观点，无菌室等未处理的地方、超净台的表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理Z前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。菌的特点是：极小，肉眼看不见。无处不在，无时不有，无孔不入。在自然条

8、件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理或化学的灭菌方法处理后的物体（当然这些方法必须己经证明是有效的），高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表而和内部都是无菌的。从以上可以看出：在地球表而无菌世界要比有菌世界小的多。灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙