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时间:2020-03-03
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1、实验三E玫瑰花环形成实验实验目的熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞(PBMC)的分离方法学习E花环试验的操作方法观察显微镜下E花环的形态实验原理本实验采用的是密度梯度离心法。该方法是根据各类血细胞比重的差异(外周血中各种细胞的密度不同,人红细胞密度为1.093,粒细胞为1.092,淋巴细胞为1.074±0.001),利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心,使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带,从而达到分离的目的。实验原理人T淋巴细胞表面的CD2分子(又称淋巴细胞功能相关抗原2)即绵羊红细胞受体(ER),在一定的实验条件下,可与绵羊红细胞(SRBC)结合,形成玫瑰花结,称为
2、E玫瑰花环试验(erythrocyte-roseetteformationtest)。应用最广的有总E花环试验(Et,t为total的缩写)和活性E花环试验(Ea,a为active的缩写)。Et代表被检标本中T淋巴细胞的总数,Ea则反映具有高亲和力绵羊红细胞受体的T细胞数,这部分T细胞的免疫学功能更能反映机体细胞免疫功能和动态变化。E玫瑰花环实验→判断细胞免疫功能TBTT淋巴细胞玫瑰花结电镜照片T淋巴细胞玫瑰花结示意图实验步骤1.取2ml人肝素抗凝血于试管中,加等量Hank’s液稀释,手动轻轻摇匀;2.用吸管吸取稀释抗凝血,缓慢加入淋巴细胞分层液上,注意保持两种液体界面清晰;3.室温下2000
3、rpm,离心20min,离心后分为4层。4.用吸管吸取血浆与分层液界面处单个核细胞层,移入另一干净试管;20℃,1500rpm,15minPBMC红细胞粒细胞Ficoll稀释外周血Ficoll稀释的血浆、血小板实验步骤5.加入5倍体积的Hank’s液吹打混匀,1000rpm离心5min,弃上清,用少量回流液重悬沉淀细胞,制成淋巴细胞悬液。6.取0.1ml淋巴细胞悬液,加入等量1%绵羊红细胞悬液混匀,1000rpm离心5min,取出。7.缓慢旋转试管底部,轻轻摇匀,吸取少许滴于载玻片上,加盖玻片,镜下观察。(Ea)人静脉取血四个同学一组;严格无菌操作;右手持注射器刺入静脉,徐徐抽取血液,达所需量
4、时,拔出针头,用无菌棉球压迫止血。静脉血立即注入肝素管中。实验结果计数花环个数,结合3个以上的SRBC为一个花环,计算Ea花环形成率,正常值为25%-40%。E花环形成率=形成花结的淋巴细胞数/淋巴细胞总数(形成花结+未形成花结)×100%
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