雄激素受体剪接体与化学疗法抵抗之间的关系以及新型前列腺癌治疗药物的研究.pdf

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1、摘要第一章：在美国男性中，前列腺癌（Prostatecancer,PCa）是第二高发病率的肿瘤同时也是致死率第二高的肿瘤。以雄激素受体（Androgenreceptor,AR）为靶标的去势疗法会导致病人发展出去势抵抗型前列腺癌（Castration-resistantPCa，CRPC），而治疗去势抵抗型前列腺癌的化学疗法又会导致更恶性的化疗抵抗型前列腺癌（Chemo-resistantprostatecancer），但是在这些复发型或难治型前列腺癌中，普遍存在配体结合结构域（ligandbinding

2、domain,LBD）缺失的雄激素受体剪接变异体（Androgenreceptorsplicingvariants,ARVs）的表达。在V567es临床数据中表明，AR-V7和AR在ARVs中的表达量占绝大多数，所以研V567es究AR-V7和AR与前列腺癌之间的关系具有非常重大的意义。我们在雄激素存在和雄激素耗尽两种条件下，对比了AR和ARVs功能的不同，例如转录活性，下游基因的表达，以及对前列腺癌细胞的生长促进等。在雄激素存在的条件下，我们通过荧光素酶实验（Luciferaseassay）发现了V

3、567esAR-V7和AR具有结合雄激素效应元件（Androgenresponseelement,ARE）V567ES的能力，利用qRT-PCR验证了AR-V7和AR可以替代AR的转录活性，激活了下游基因的转录，例如前列腺特异抗原（Prostatespecificantigen，PSA）V567es等，用westernblot证明了AR-V7和AR促进了AR下游基因PSA等的表V567es达，而且细胞增殖实验的结果表明，AR-V7和AR促进了前列腺癌细胞的V567es生长，但是在雄激素耗尽的条件下，A

4、R-V7和AR的在蛋白表达、转录活性以及细胞增殖方面，比AR有更强的促进作用。以上研究结果为无雄激素存在的情况下，AR信号通路为何还会被激活，病人为何会产生去势抵抗，提供了潜在的解释。我们还比较了AR和ARVs对于化疗药物的不同反应，我们利用紫杉醇（Paclitaxel，PTX）和多西紫杉醇（Docetaxel，DTX）这两种常见化疗药物对-I表达AR和ARVs的前列腺癌细胞进行处理，通过细胞核转移实验（Translocationassay）、荧光霉素实验（Luciferaseassay）、定量PCR

5、和免疫印迹（Westernblot）等实验手段，我们观察到了无论是在有雄激素或无雄激素存在的情况下，PTX和DTX对AR的核转移、表达水平、转录活性和对肿瘤细胞的生长促进方面都有很强的抑制效果，但是对于ARVs在以上这些方面则没有明显的抑制的效果。在无雄激素存在的情况下，当AR与ARVs共表达时，ARVs可以协助AR完成核转移，甚至ARVs可以协助AR逃脱紫杉醇对于AR核转移的抑制。由于紫杉醇类化疗药物的作用靶标是微管（Microtubules，MTs），所以我们试图通过研究AR和ARVs与MTs的相

6、互作用来解释ARVs对于紫杉醇的抗药机理，微管体内结合实验（Microtubuleinvivobindingassay）的结果说明，AR可以和MTs结合，而ARVs则不能，我们进一步利用微管体外结合实验（Microtubuleinvitrobindingassay）证明了在没有其他蛋白复合体参与的情况下，AR与微管可以直接结合。为了确定AR蛋白与微管结合的具体位置，我们构建了一系列AR功能区的缺失突变体，研究了他们与微管结合能力的差异和这些突变体在细胞内的定位差异，通过对比这些突变体与微管结合能力的差

7、异并结合他们在细胞内分布的不同，结果发现了AR734-AR774片段对于AR和微管的结合有着至关重要的作用，而且这段序列不存在于ARVs，所以我们推断微管结合序列（MTAS）位于AR734-AR774。综上，ARVs中AR723-AR795的缺失，决定了ARVs不能与微管结合，进而失去了紫杉醇对微管结合蛋白的抑制，使得细胞对紫杉醇的敏感性降低，本论文结果为研究前列腺癌化疗抵抗提供了重要的理论依据，也为临床治疗化疗抵抗型前列腺癌具有重大的科学意义。关键词：前列腺癌；雄激素受体；雄激素受体剪接突变体；微管

8、；化疗抵抗第二章：有证据表明，Src作为一种原癌基因在前列腺癌中大量表达，尤其Src在雄激素非依赖的肿瘤生长和前列腺癌骨转移中起着非常重要的作用，一种新型的Src抑制剂KX-01（KX2-391）已经进入二期临床试验。我们通过研究核转移实验、荧光霉素实验、实时定量PCR和MTT等实验方法，发现了KX-01可以抑制AR的核转移、转录活性、下游基因的转录活性和对肿瘤生长的促进。同时发现了KX-01还可以抑制ARVs的转录活性，下游基因的表达以及肿瘤的生长促进