PCR原理及其操作(高中).ppt

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1、PCR反应原理及其操作1.PCR的基本原理2.PCR反应体系3.PCR的基本步骤PCR的基本原理试管中进行的DNA复制反应，依据DNA半保留复制的机理；体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质；通过人为控制体外合成系统的温度，使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）引物　　　　各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol

2、/LPCR的基本步骤1. DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。2.退火（复性）（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。高温变性低温退火中温延伸在引物作用下，Taq酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引

3、物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCR每一步的转换通过温度的改变控制。DNA模板解链（变性）、引物与模板结合（退火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合成（延伸）三个步骤构成PCR反应的一个循环。此循环反复进行，可使目的DNA得以迅速扩增。理论扩增率：2n递增（n为循环次数），25～30循环，目标DNA可增加109倍。由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式。以上“变性、退火、延伸”三部曲为PCR一轮循环。PCR扩增曲线