PCR操作原理及应用课件.ppt

《PCR操作原理及应用课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、PCR技术的原理、操作及应用什么是PCRPCR:Polymerasechainreaction，即聚合酶链式反应，实质就是体外基因复制技术；是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术PCR技术的发展历史关于PCR的文章首次由美国科学家KaryMullis等人在《Science》杂志上发表《Science》杂志报道了耐热性DNA多聚酶Taq酶（生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐热的DNA聚合酶）的发现，预示着分子时代的到来。12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。1993KaryMull

2、is因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。PCR技术的原理遗传物质：细胞核染色体DNA（脱氧核糖核酸和磷酸链和碱基构成)碱基（A、T、C、G）是按双链螺旋排列的，碱基序列的长度和排列的顺序决定了生物的多样性。比如人类体细胞中共有31亿个碱基对PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。PCR反应的基本成分包括6种基本成分：模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子

3、、缓冲液基本反应步骤：变性--退火--延伸最后通过染料如EB染色DNA后在紫外灯下显色检出1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~35轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR循环第一步–加热变性靶序列靶序列从组织或细胞中提取的DNA约1ug，在含有适当缓冲液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等的反应混合物中，在94℃下热变性1-4分钟，使之解为单链。7PCR循环第二步–引物与靶

4、序列退火靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’引物与解为单链的DNA上互补序列杂交在一起，称之为退火。55℃左右8PCR循环第三步-引物延伸靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs为原料（底物），从引物的3’端A开始,沿着5’→3’的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。72℃左右9第1个PCR循环完成后靶序列靶序列BiotinBiotin30次

5、循环后靶序列扩增的数量No.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon11RT-PCR的原理相对于PCR，在开始阶段增加步骤：RNAcDNA合成，是单链到双链的过程。实时荧光定量PCR的原理实时

6、荧光定量PCR技术(Real-TimeQuantitativePCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。基线（Baseline）是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。光阈值threshold的设定一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。Ct与初始模板的关系固定循环数后，荧光信号与模板数成正比初

7、始DNA量越多,荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct值)越少起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量阈值104103102PCR技术的优点优点:特异敏感快速、简便易自动化等PCR技术的局限性为了构建特定引物，使特定DNA序列的选择性扩增，必须有一个庞大的已知序列的数据库。聚合酶链反应效率差异很大，根据不同的因素需要优化反应条件。PCR技术扩增产物的长度有限。PCR技术的注意事项防止污染，建立良好的质量控制。操作时避免气溶胶产生，特别注意阳性样品的拿放，使用一次性耗材，穿戴手套并经常更换，永远在

8、最后一步才加核酸，液体分装使用等。引物设计合理Taq酶扩增错误率较高，大约1/100对碱基/20个循环镁离子浓度对反应效率的影响仪器稳定性，升降温速率，管子的密合度等RT-PCR注意防止RNA降解PCR技术的操作以PED病毒的RT-PCR和Real