蛋白质含量测定法.ppt

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1、蛋白质含量测定法考马斯亮兰法（Bradford法）实验原理考马斯亮蓝G-250染料+碱性芳香族氨基酸在磷酸的作用下，最大吸收为595nm(兰色）器材与试剂722型和753型可见光分光光度计漩涡混合器试管16支标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA），配制成1.03mg/ml和0.103mg/ml。考马斯亮兰G-250染料试剂：称100mg考马斯亮兰，溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀释至1升。实验方法标准方法取10支试管，分别编号后按表1-1剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮兰染料。每

2、支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。加完染料20min后，使用722分光光度计（灵敏度4），塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A595。用标准蛋白浓度（mg/ml）为横坐标，用A595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。根据测得的未知样品的A595，查表即可求得未知样品的蛋白质含量。微量法取10支试管，分别编号后按表1-3剂量依次加入稀释的标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮兰染料。其他步骤同上，不过使用753分光光度计（狭缝4）。SDS干扰实验取5支试管，分别编号后按表1-5剂量依次加入标准蛋白、SDS、去离子水和考马斯

3、亮兰染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。加完染料20min后，使用753分光光度计（狭缝4），塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A595。实验数据与结果分析标准方法的数据和图表1考马斯亮兰标准法实验表格管号12345678910标准蛋白质（1.03mg/ml）00.010.020.040.060.080.10未知蛋白质（约0.5mg/ml）0.040.080.10蒸馏水0.10.090.080.060.040.0200.060.020考马斯亮兰G-250试剂3.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0对应的

4、吸光度A5950.2000.3110.3620.4830.6240.7520.8450.3870.5010.572根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。图1考马斯亮兰标准法图1考马斯亮兰标准法微量法的数据和图表2考马斯亮兰微量法实验表格管号12345678910标准蛋白质（0.103mg/ml）00.10.20.40.60.81.0未知蛋白质（约0.5mg/ml）0.40.81.0蒸馏水1.00.90.80.60.40.200.60.20考马斯亮兰G-250试剂3.03.03.03.03.03.03.0

5、3.03.03.0对应的吸光度A59500.0880.1840.2920.4110.5420.6310.1710.2890.362根据表2，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图2。图2考马斯亮兰微量法SDS干扰数据和图表3考马斯亮兰SDS干扰实验表格管号123456标准蛋白质（1.03mg/ml）0.10.10.10.10.10.1SDS(1mg/ml)00.10.20.40.60.8蒸馏水0.90.80.70.50.30.1考马斯亮兰G-250试剂3.03.03.03.03.03.0对应的吸光度A5950.423

6、0.3360.2750.2000.2130.198根据表3，以A595为纵坐标，SDS浓度为横坐标，作图3。图3考马斯亮兰SDS干扰实验由上图可以看出，十二烷基硫酸钠(SDS)对考马斯亮兰法测蛋白质含量有干扰，同是0.103mg/ml的标准蛋白与3.0ml考马斯亮兰，但随着SDS浓度的增加，其混合液的595nm处的吸收峰逐渐降低，而后有一小段回升，最后趋于渐近线。紫外吸收法[实验原理]280nm的光吸收法：蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处有最大吸收。215nm与225nm的吸收差法：蛋白质因为含量低而不能使用280

7、nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。肽键测定法：蛋白质溶液在238处的光吸收强弱，与肽键的多少成正比。可以测238nm处吸收值，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。[器材与试剂]（一）器材1．SPECORD200分光光度计2．漩涡混合器3．试管12支（二）试剂标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA），配制成1.03mg/ml。[实验数据与结果分析]（一）紫外280nm吸收法数据和图表4紫外280nm光吸收法管号123456BSA(1.03mg/ml)体积01.02.03

8、.04.05.0H2O5.04.03.02.01.00BSA浓度（mg/ml）00.2060.4120.6180.8241.03A28000.1580.2700.3790.5140.645根据表4，以A280为纵坐标，S