酶联免疫吸附剂测定实验（elisa）.doc

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1、酶联免疫吸附剂测定实验（ELISA）姓名：夏晶学号：2009011642班级：力9同组人员：奚柏利一、实验原理ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA）。基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。此次实验采用间接法，是检测抗体最常用的方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原

2、或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。二、实验试剂及器材器材：聚苯乙

3、烯微量细胞培养板(平板,96孔)，酶联免疫检测仪试剂：辣根过氧化物酶羊抗兔IgG包被液（0.05mol/L碳酸缓冲液（pH9.6），Na2CO30.15克，NaHCO30.293克，用蒸馏水稀释至100毫升）稀释液（PBS-Tween）（NaCl8克,KCl0.2克，KH2PO40.2克,Na2HPO4·12H2O2.9g,Tween-20，0.5毫升，用蒸馏水加至1000毫升）洗涤液：同稀释液。封闭液：0.5%（质量分数）BSA（用PBS配制）。邻苯二胺溶液(底物)（0.1mol/L柠檬酸(2

4、.1克/100毫升)取6.1毫升，0.2mol/LNa2HPO4·12H2O(7.163克/100毫升)取6.4毫升，加蒸馏水12.5毫升，取邻苯二胺8毫克（溶解），临用前加30%（体积分数）H2O240微升）终止液：2mol/LH2SO4。三、实验步骤1.包被抗原1）用包被液将抗原作适当稀释,一般为1~10微克/孔，用微量加样器每孔加200微升（用定量多道加液器，使加液过程迅速完成）,37℃温育半小时。2）洗涤：a倒尽孔中液体后每孔加200微升洗涤液，将洗涤液注满板孔.b放置1-2分钟，间歇摇

5、动，甩去液体后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。c反复三次。3）每孔加封闭液200微升，37℃温育半小时。4）洗涤同2。2．加被检血清1）用稀释液将被检血清作几种稀释（稀释倍数见下表格）。2）对选定的36个孔分为12组，其中10组每孔按组别加入浓度不同的200微升；1组加稀释液，以为对照；1组不处理。3）37℃温育一小时。4）洗涤同2。3.加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG1）每孔加入200微升,37℃温育半小时。2）洗涤同2。4.加底物邻苯二胺1）邻苯二胺溶液（邻苯二胺在临用前才加入，用前还

6、要加30％H2O2）每孔加200微升。2）放在室温暗处15分钟左右至相应孔内出现橘黄色。5.终止及观察1）每孔加终止液50微升。.2）用酶联免疫检测仪处理并记录OD490nm的读数三、实验结果此处错误图中红色字体的数据为实验误差所导致，计算平均值时已忽略（第九组实验数据完全错误）三、实验心得这次是我来清华做的第三次试验，感觉有点激动，因为平时很少能有这么好的实验条件，亲自动手，去做一些较为复杂的实验，而这次，得以亲自参与完成这个目前老说做过的最复杂的实验，还是非常高兴的，虽然上课时迫切的想亲自做

7、实验，但还是认真地听了老师的讲课，不管怎么说，要做实验首先得要听懂试验嘛，这次老师几乎全是用英文讲的，但是还是多多少少听懂了实验的步骤与原理，其实，在以前上生物课老师从来都是不用英文讲的，但今天的课，多多少少让我感觉到了生物国际化的氛围，即生物是一门越来越国际化的学科，要想学到更好的生物知识，就要学好英语，才能更好的交流，从而学到国际化的高层次的知识。其次，在接下来的试验中，我和奚柏利配合得也很好，分工明确，互相帮助完成了这次试验，但是可能由于实验做得不够仔细，导致了结果还是有点不太理想，我们也

8、分析了原因，是因为我们在转移不同浓度的稀释液时没有更换滴头，导致未加的也出现的加的现象，所以，我在以后做实验室一定要认真仔细，抓住细节，从每一个细节做起，将每一次生物实验做好！