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《大豆叶片总RNA提取实验方案.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、大豆叶片总RNA提取(1)实验样品的研磨将大豆幼苗叶片剪碎示用研磨棒研磨，期间不断加入液氮，肓至裂解液呈无明显碎片的粉末状;转入离心管后，加入1mUTotalRNA提取试剂Trizol溶液室温静置5min;⑵将静置5min钟后的裂解液12000转,4。C离心5min,小心吸取上清液，转移入新的离心管屮；(3)向上清裂解液加入氯仿(为加入Trizol溶液的1/5体积量)，盖紧离心管盖，振荡，待充分乳化溶液呈乳状(无分相现象)后，室温静置5min;(4)12000g,4°C离心15min;(5)吸取上清液转移至另一新的离心管屮，向上清屮加入等体积的异丙醉，上下颠倒离心管
2、充分混匀后，室温静置10min;⑹12000rpm,4°C离心lOmin,弃上清,RNA沉于管底；(7)缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醉1mL(切勿触及沉淀),轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁,12000g,40C萬心5min后小心弃去乙醇;(8)将离心管至于超净丁•作台小室温干燥5min左右，加入适量的RNase-freezK溶液沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解示，经过电泳和紫外分光光度计(A26O/A280)检测样品的RNA浓度和质量，于C保存。1.3.5GmDGATs基因反转录与PCR扩将提取的TotalRNA3取2[xg,用逆转录酶(Pro
3、mega)进行逆转录反应，合成得到cDNAo将得到的cDNA用于PCR扩增，用KOD-Plus-NeoStage1.预变性Stage2.变性退火延伸(TOYOBOCode:KOD・401)进行PCR反应,扩增反应条件如下:94°C5min;94°C30sec
4、**°C45sec28循环;72'C1min・丨Stage3.最后延伸72°C10min1.4.2PCR反应扩增GmDGATs以138中保存的菌株质粒(GmDGATs・pGEM・TEasy)为模板，进行PCR扩增反应。将提取的质粒，取2畑用于PCR扩增。用KOD-Plus-Neo(TOYOBOCode:KOD-
5、401)进行PCR反应，扩增反应条件如下：Stage1.预变性94C5min；Stage2.变性94*C30sec、退火"°C45sec》28循坏;延伸72*C1min-Stage3.最后延伸72r10min1.4.2GmDGATs基因与pRT105-Flag载体连接将PCR产物回收与pRT105-Flag载体按上表所示的酶切位点酶切，酶切4h后电泳并回收日的基因与载体，进行连接反应，4°C过夜，反应体系同136：1.4.3GmDGATs-pRT105-Flag质粒的验证将连接产物转染DH5a菌株（方法同1.3.7）,次日在平板上挑取白色克隆，加入10mL液体LB（
6、100gg/mL氨节青霉素），在370200rpm/min摇床中振荡培养12〜14h。ImL菌液用于保菌，甘油浓度为30%；2mL菌液使用质粒小量制备试剂盒（上海捷瑞）进行质粒抽提，用于酶切验证，分别用XbalI,SoZI酶切4h。选取酶切结果正确的菌株质粒，送至上海美吉公司进行测序。1.4.5原生质体的提取方法以及PEG转化原生质体的提取实验主要参照JenSheen实验室的方法（Yoo等，2007）。（1）将还没有开花的正常生长至37星期的完全展开的叶片（一般是第5〜7片叶子）用双面刀片切成宽度为0.5〜1inni的细条，然后放置与新鲜配置好的原生质体分离酶液中，
7、将叶片完全浸没；（2）在黑暗的条件下，将酶溶液放置于真空泵中，抽气30min；o（3）将酶解液放置在摇床上，室温，黑暗条件下摇动（约40ipm/min）,酶解3h；（4）用显微镜检査酶解的原生质体，拟南芥原生质体的直径大约为3350gm；<5）酶解好后，向酶解夜中加入等体积的W5溶液，然后用75呻孔径的尼龙网过滤酶酶解液；（6）将过滤在50ml离心管中含有原生质体的酶液在室温，100g离心2min,离心机的升速和降速的速率较低；（7）将上清轻轻的吸走，然后用适量的W5溶液重新悬浮原生质体，用血球计数板在显微镜下估算原生质体的浓度，用W5溶液调至约2xl05个/ml,
8、其余的原生质体在冰上放置30min；（8）原生质体靠重力作用沉降到管子底部，轻轻移除W5溶液，尽可能不要碰到原生质体，然后用MMG溶液重新悬浮原生质体，约2x10'个/ml,放置在室温。PEG方法转化质粒到原生质体(1)将约10-20gg的质粒DNA加到2ml离心管中，加入lOOpl原生质体，轻轻混合好；(2)加入110皿PEG溶液，通过轻轻的拍打管子将溶液混合好(拍打410次)。然后在室温放置5-15min；(转化时间主要以经验为主，最好不要超过30mb)(3)向转化液中加入40(M50M1W5溶液，轻轻反转管子混合，终止转化过程，(4)室温，100g转速离心
