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1、动物源弯曲杆菌的分离与鉴定1范围本标准规定了动物源空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的分离鉴定方法。本标准适用于粪便拭子和盲肠内容物中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的分离与鉴定。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌与培养设备外，其他设备和材料如下。2.1采样管2.2采样棉拭子2.3生物安全柜2.4恒温培养箱：25°C±1°C,36°C±1°C,42°C±1°C。2.5恒温水浴锅：37°C〜100°Co2.6微需氧条件：5%氧气+10%二氧化碳+85%氮气，或商品化微需氧包。2.7显微镜：10X〜100Xo2.8微生物生化鉴定系统或者生化鉴定拭条2.9高速冷冻离心机：^1
2、2000r/mino2.10小型离心管：1.5mLo2.11微量加样器：1uL〜lOOOuL。2.12吸头（与微量加样器相匹配）2.13PCR仪2.14微波炉2.15电泳仪2.16电泳凝胶成像分析系统（或紫外透射仪）3、培养基和试剂2.1质控菌株：空肠弯曲杆菌标准菌株（ATCC33560）2.2DNAMarker2.3引物及扩增片段长度2.3.1引物空肠弯曲菌：上游5'CATCTTCCCTAGTCAAGCCT3',下游5'AAGATATGGCACTAGCAAGAC3',扩增片段长度为773bpo结肠弯曲杆菌：上游：AGGCAAGGGAGCCTTTA
3、ATC,下游：TATCCCTATCTACAAATTCGCTATCCCTATCTACAAATTCGC,扩增片段长度为364bp。3.4运送培养基2.5弯曲菌选择性(CCD)培养基3.6哥伦比亚血琼脂培养基3.7生理盐水3.810XPCR缓冲溶液II3.9氯化镁溶液(25mM)2.10Taq聚合酶(0.5U/nL)2.11dNTPs(2mM)2.12琼脂糖2.1350XTAE缓冲液：将242gTris碱，57.lmL冰乙酸，lOOmLO.5MEDTA(pH8.0),加纯水至lOOOmLoIXTAE缓冲液：临用时将50XTAE缓冲液1份加蒸馆水49份，混
4、匀即可。3.14上样缓冲液3.15澳化乙锭溶液(lOmg/mL)：称取lg澳化乙锭溶于100mL水中，用磁力搅拌器搅拌数小时直至完全溶解，避光冷藏(4°C)保存。3.16矿物油4空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的分离与鉴定程序空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的分离与鉴定程序见图4。图4弯曲杆菌的分离和鉴定程序5操作步骤5.1分离与纯化5.1.1分离将新鲜或者运送培养基中的粪便拭子或盲肠内容物在CCD培养基上涂抹，用经火焰灭菌并冷却的接种环与涂抹处垂直划线。5.1.2培养将上述接种后的平板置于42*土11恒温培养箱中，在微需氧条件下培养24h-48ho5.1.3
5、纯化观察24h培养与48h培养的琼脂平板上的菌落形态。挑取灰色、湿润、凸起、光滑圆润、边缘整齐的可疑单菌落，按3.2的培养条件培养纯化。5.2鉴定5.2.1生化鉴定对于已纯化的菌落，可使用微生物生化鉴定系统或者生化拭条进行生化鉴定,并进行结果判定。或者通过5.1-5.4的试验进行分子生物学（PCR）鉴定。5.2.2分子生物学（PCR）鉴定用接种环从哥伦比亚血琼脂培养基上挑取适量的纯培养物置于盛有0・5mL生理盐水的小型离心管中,12000r/min离心加in,弃上清。再加0.5mL灭菌水，悬浮并涡旋混匀，10（TC沸水中煮沸lOmin后，取出置于冰
6、浴中冷却5min后，12000r/min（4°C）离心2min,取上清作为PCR模板。5.2.2.1PCR反应体系根据不同厂家PCR试剂用量，配制PCR反应体系。同时设立阴性和阳性对照。5.2.2.2PCR反应条件采用的PCR反应条件见下表。PCR反应程序表5min,94°Clmin,94°C,lmin,64°C,lmin,72°C,2*lmin,94°C,lmin,62°C,lmin,72°C,2*lmin,94°C,lmin,60°C,lmin,72°C,2*lmin,94°C,lmin,58°C,lmin,72°C,2*lmin,94°C,l
7、min,56°C,lmin,72°C,2*lmin,94°C,lmin,54°C,lmin,72°C,30*10min,72°C5.2.2.3电泳5.2.2.3.11.0%琼脂糖凝胶板的制备称取l.Og琼脂糖,加入lOOmLO.5XTBE缓冲液（或1XTAE缓冲液）中。加热融化后加5uL（10mg/mL）澳化乙锭，混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5nmi左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子（胶中形成加样孔），放入电泳槽中，加0.5XTBE缓冲液（或1XTAE缓冲液）淹没胶面。5.2.2.3.2加样取IOlaLPCR扩
8、增产物和3yL上样缓冲液混匀后加入一个加样孔。每次电泳加阳性对照和阴性对照的扩增产物各1孔作为对照。5.2.2.3.3电泳
