GBT18653-2002胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法

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1、免费标准下载网(www.freebz.net)GB/T18653-2002前言本标准是依据加拿大国家动物疾病研究所的实验室操作规程，结合本国实际情况制定的，通过大量试验，证实该方法准确可靠。本标准的附录A是标准的附录，附录B是提示的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:天津动植物检疫局。本标准主要起草人:秦贞奎、侯艳梅、张碧波。免费标准下载网(www.freebz.net)无需注册即可下载免费标准下载网(www.freebz.net)中华人民共和国国家标准GB/T18653-2002胎JL弯曲杆菌的分离鉴定方法Me

2、thodsforisolationandidentificationofcampylobactorfetus1范围本标准规定了胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法本标准适用于牛、绵羊、冷冻精液胎儿弯曲杆菌的检验，其他动物可参照使用2胎儿弯曲杆菌的分离鉴定2.1设备和材料2.1门混合气体[质量比为3.5%氧(00,10%二氧化碳(C02),86.5%氮(N,)口。2.1.2厌氧培养罐。2.1.3采样棒及吸球2.1.42mL注射器，5号针头，20号针头。2.1.5灭菌青霉素瓶及生理盐水。2.1.6供常规细菌分离鉴定用的基本设备与材料。2.2培养基和试剂〔见附录A(标准的附录)〕。2.2,

3、1增菌运输培养基(TEM)o2.2.2半胧氨酸牛心浸膏培养基((CH),2.2.3琼脂培养基(MH),2.2-4疏基乙酸盐肉汤。2.2.5相关生化试剂。2.3胎儿弯曲杆菌的分离鉴定程序见附录B(提示的附录)示意图。2.4分离培养2.4.1样品采集2.4-1-，母牛站立或六柱栏保定，用5%来苏儿消毒牛的外阴部，将采样棒的采样端插人阴道，压扁另一端的吸球，并来回抽动，吸取阴道粘液。取出采样棒后，插人盛有3mI灭菌生理盐水的小瓶中吹吸数次，再将采样棒放人消毒液中。2.4.1.2公牛六柱栏保定，用绳子固定采样侧的后肢，剪短阴筒外部的阴毛，用5%的来苏儿消毒公牛的尿道口，将采样棒的采

4、样端插人阴筒内，将另一端的吸球压扁并来回抽动，吸取包皮液。取出采样棒迅速插人盛有3ml灭菌生理盐水的小瓶中吹吸数次。2.4.1.3样品液静置1min-2min，用灭菌注射器吸取上清液2mL，分别注人两瓶增菌运输培养基(见附录A中A1)中，每瓶1mL。振荡混匀，尽快送至实验室。2.4-1.4取样品做革兰氏染色并做湿涂片镜检。也可用棉拭子荫取样品液直接涂布于含抗菌素的MH(见附录A中A3)或CH(见附录A中A2)琼脂平板上。2.4.2已接种样品的增菌运输培养基置37'C培养72h。用直径3mm的接种环将增菌液分别划线于两个MH或CH平板培养基上，将平板放置厌氧培养罐中，将雄内空

5、气抽出，达到一5.5kPa时停止，充中华人民共和国国家质f监督检验检疫总局2002一02一19批准2002-05一01实施标准分享网www.bzfxw.com免费下载免费标准下载网(www.freebz.net)无需注册即可下载免费标准下载网(www.freebz.net)Gs/T18653-2002人经0.22pm滤膜过滤的混合气体至负压为零，再将气体抽出和充人反复两次。将培养罐在37C培养72h。以后胎儿弯曲杆菌均需在混合气体条件下培养。2.4.3观察MH,CH培养基上有无疑为胎儿弯曲杆菌的菌落，如无可弃之如有，将典型或可疑菌落划线于MH或CH琼脂平板培养基上培养72h

6、e胎儿弯曲杆菌在MH或CH平板培养基上的菌落特征为:不溶血、半透明、光滑、周边整齐、圆整、直径为1mm左右。2.5鉴定2.5，，筛选试验2.5.1.，取典型或可疑纯培养物做革兰氏染色、湿涂片动力观察、氧化酶试验及过氧化氢酶试验(试剂配方见附录A中A5,A6)o胎儿弯曲杆菌为革兰氏染色阴性，呈螺旋状或“S,，状，一些老龄培养物可出现球状或球杆状，不形成芽胞和荚膜，在菌体的一端或两端有鞭毛，呈特征快速螺旋状穿梭运动。氧化酶试验为阳性5.1.2纯培养平板用后尽快放回混合气体环境中，以备进一步做生化试验用。:5.2生化试验2.5-2.1将符合2.5.1.1条的培养物按表1进行生化试

7、验。表1胎儿弯曲杆菌生化反应生长试验药敏试验硫化氢马尿酸过氧化氢氧化酶菌名(H,S)1%胆3.5%抓蔡陡酮头抱称素钠水解酶试验25C42C1%甘试验试验氨酸汁化钠(N.Cl)酸300g/片30pg/片试验胎儿弯曲杆于++++RS十菌胎儿亚种胎儿弯曲杆+++RS菌性病亚种2.5-2.2所有生化试验管均于混合气体环境中培养3d。带胶盖或螺旋盖的试管，培养时应将试管盖放松。2.5.2.3生长试验:纯培养后的菌接种到2管疏基乙酸肉汤(见附录A中A4)中，分别放43℃和25C温箱培养72h观察结果，肉汤上层出现雾状混浊时，说