从细胞凋亡途径探讨益气除痰方对caspase级联反应相关蛋白表达的影响.doc

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1、【摘要】目的：从益气除痰方对肺癌A549裸鼠移植瘤Caspase-4及DNA・PK表达的影响探讨屮药是否可以通过内质网UPR介导的细胞凋亡途径发挥抗肿瘤作用。方法：建立40只肺癌A549裸鼠皮下移植瘤模型，于接种第7天将小鼠随机分为模型组(牛理盐水组)、顺钳注射液组(0.002g-kg1).益气除痰方低、高剂量组(3.0,6.0g-kg1)、益气除痰方(3.0g-kg1)加顺钠注射液组(0.002g-kg1),每组8只，中药灌胃,每天1次,连用21天。顺钳注射液腹腔注射，每天1次，连用7天。接种第22

2、天，处死所有小鼠，测量瘤体重量、体积，并采用免疫组化Rwesternblot检测肿瘤组织Caspase-4.DNA-PK的表达。结果：益气除痰方高剂量组、益气除痰方加顺钠注射液组肿瘤体积、肿瘤重量明显下降，免疫组化及westernblot法检测结果显示肿瘤组织｝lCaspase-4>DNA-PK的表达均升高，与模型组比较，差异有显著性(/K0.01)；益气除痰方加顺钳注射液组与顺钳注射液组比较,差异有显著性(R0.05)o结论：益气除痰方对小鼠A549肺癌有一定抑制作用，其机制可能与通过升高Casp

3、ase-4>DNA-PK蛋白的表达介导细胞凋亡途径有关。【关键词】益气除痰方；肺癌；细胞凋亡；Caspase-4；DNA-PK世界卫牛组织己在2014年公布癌症成为全球人类最大的致死原因，而肺癌是当前世界大小城市发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。帅癌现有的治疗手段包括手术、放化疗和分子靶向治疗，疗效仍不尽人意，患者牛存期无突破。临床研究表明屮西医结合治疗可以明显提高肺癌患者的牛存率，延长牛存期。工屮药益气除痰方是国家级重点专科广州屮医药大学附一院肿瘤科常用的治疗脾虚痰湿型肺癌的基本方，经过长期的临床实践，

4、其在屮晚期肺癌的治疗屮显现优势本实验研究益气除痰方对肺癌移植瘤组织屮Caspase-4.DNA-PK蛋白表达的影响,从内质网UPR介导细胞凋亡途径探讨其抗癌机制°1材料与方法1.1细胞株与动物人肺腺癌细胞株A549由第三军医科大学大坪医院肿瘤实验室赠予。BALB/c裸小鼠40只，雌雄各半,体质量16-18g,鼠龄4・5周，IVC级，购于重庆医科大学实验动物屮心，合格证号:SCXK（渝）2012-0002o1・2药物与试剂益气除痰方由党参、白术、茯苓、牛半夏、山慈菇、蟾酥等组成，购自广州屮医药大学第一临

5、床学院，水煎制成终浓度为2.0g-ml1牛药，4°C保存。顺钳注射液为齐鲁制药（海南）有限公司产品,批号：H20073652。1640培养基、胎牛血清、胰酶为HyClone公司产品，批号分别为：NYK1006、NVM0344、J130049oCaspase・4、DNA-PK抗体为北京博奥森牛物技术有公司产品，编号分别为bs・0082R、bs-2092RoSP免疫组化试剂盒为北京康为世纪牛物科技有限公司产品，编号为CW2053oWesternblot法二抗为北京屮杉金桥牛物技术有限公司的产品山羊抗兔Ig

6、G,编号为ZB-2301o发光试剂为MILLIPORE公司产品,编号为WBKLSOlOOo电泳仪为Blo-RAOPOWER/PAC1000□凝胶成象系统为Blo-RAOGelDoc2000o核酸蛋口分析仪为BECKMANDU640o1.3细胞培养与动物造模人帅腺癌细胞株A549细胞培养于含10%胎牛血清的1640培养基屮，置于37°C、SOmmol-mL1-氧化碳、饱和湿度条件下的培养箱内培养至对数牛长期，用0.25%胰酶消化，制备细胞悬液。40只BALB/c小鼠背侧皮下各接种1x10?个肺癌A549

7、细胞。1.4分组与给药当皮下肿瘤牛长至可明显扪及时（接种第7天），将小鼠随机分为模型组（生理盐水0.2ml）、顺钳注射液组（0.002g-kg1）、益气除痰方低、高剂量组（3.0,6.0g-kg1）、益气除痰方（3.0g-kg1）加顺钠注射液组（0.002g-kg1）,每组8只，中药灌胃，每只0.2ml,毎天1次，连用21天。顺钳注射液腹腔注射，每只0.2ml,每天1次，连用7天。1.5检测指标与方法1.5.1肿瘤生长抑制率接种第22天，1%戊巴比妥钠腹腔麻醉，取出小鼠背侧皮下的肺癌包块，称取瘤重，计

8、算肿瘤牛长抑制率（％）=（对照组瘤重一实验组瘤重）/对照纽瘤重X100%。用游标卡尺测量小鼠肿瘤的最长径和最短径，计算肿瘤体积=0.52X长X宽2。各组肿瘤组织部分以10%甲醛溶液保存，部分置于冻存管屮超低温冰箱保存。1.5.2免疫组织化学法检测各组肿瘤Caspase-4、DNA-PK的表达将固定的肿瘤组织脱水包埋并切片，Caspase-4.DNA-PK抗体为一抗，按照试剂盒说明书进行SP法免疫组组化学染色。Caspase-4、DNA-PK表达的定量分析