消瘀化痰方对非酒精性脂肪肝大鼠肝细胞凋亡和caspase3蛋白表达的影响

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1、消瘀化痰方对非酒精性脂肪肝大鼠肝细胞凋亡和Caspase3蛋白表达的影响作者：赵润生张一盺苗卉周桦吴翟李昌【摘要】　　目的观察中药消瘀化痰方对非酒精性脂肪肝（NAFLD）大鼠肝细胞凋亡和肝组织caspase3蛋白表达的影响，探讨其防治NAFLD的部分作用机理。方法采用高脂饮食喂饲大鼠复制NAFLD模型，以东宝肝泰为对照药，运用流式细胞仪观察各组大鼠肝细胞凋亡及肝组织caspase3蛋白表达的变化，同时采用HE染色观察各组大鼠肝组织形态学变化。结果镜下可见模型组大鼠肝脏中度以上脂肪变性，并有少量的肝细胞坏死；流式细胞术分析可见其细胞

2、凋亡率明显增高（P＜0.01），caspase3蛋白表达FI值增高（P＜0.01）。与模型组比较，各用药组肝脂变程度显著改善，肝细胞的凋亡率明显下降（P＜0.01），caspase3蛋白表达FI值降低（P＜0.01）。结论消瘀化痰方通过抑制caspase3蛋白的表达，抑制肝细胞的凋亡，以达到抗脂肪肝作用。【关键词】消瘀化痰方非酒精性脂肪肝细胞凋亡Caspase3蛋白　　Abstract:ObjectiveToobservetheeffectofXiao-Yu-Hua-Tan-Yinonhepaticapoptosisandcasp

3、ase3innonalcoholicfattyliverrats(NAFLD).MethodsThenonalcoholicfattyliverratmodeletry(FCM)icroscopeediumorserioussteatosisbyopticalmicroscope,andafeodelgroupodelgroup,liverfatcelldenaturizingproved,andtherateofcellapoptosisandexpressionofcaspase3entgroup(P＜0.01).Conclu

4、sionXiao-Yu-Hua-Tan-Fangcaninhibithepaticapoptosisinhibitingbytheexpressionofcaspase3,andprotectnonalcoholicfattyliver.　　Keya公司提供。　　1.3仪器　　FACScan-420型流式细胞仪，美国BecktonDickinson公司产品。　　2方法　　2.1动物分组与造模50只健康雄性SD大鼠，饲养于18～22℃明暗各12h的清洁级动物实验室内，正常喂养1周后，随机分为5组，即：正常对照组（简称正常组），模型对

5、照组（简称模型组），消瘀化痰方高、低剂量组（简称高、低剂量组），阳性药（东宝肝泰）对照组（简称对照组）。动物造模参照　　2.3指标检测　　2.3.1肝组织形态学观察取大鼠部分肝组织用4%的多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜观察。　　2.3.2肝细胞凋亡及肝组织Caspase3蛋白表达的流式细胞术分析单细胞悬液的制备：取已固定肝组织放于120目不锈钢网上，下置一平皿，用眼科剪刀将组织剪碎至1mm×1mm×1mm大小，轻搓组织，边搓边以PBS液冲洗，直至将组织搓完。将平皿中的混悬液用300目筛网过滤去除细胞团块，收集

6、细胞悬液，1000r/min，离心3min，弃上清，保留沉淀，加入PBS0.3ml，稀释混匀后，将单细胞悬液分成2份，调整每份样品的细胞数为1×106，用于检测肝细胞凋亡情况。细胞凋亡DNA含量染色：采用PI一步插入性DNA定量荧光染色方法，染液中含PI50μg/ml，RNA酶100μg/ml，Triton-X1001.0%。取上述制备的单细胞悬液1份，加入PI－DNA荧光染色液1ml，置4℃冰箱染色30min，以500目筛网过滤后上机检测。测量的数据输入计算机，应用Expo32ADC软件进行免疫荧光数据分析，用Muticycle

7、AV分析软件对DNA细胞周期拟合分析。采用Barlogie的细胞图解法分析，将处于不同时期的细胞分为3部分，即：G0/G1期、S期、G2/M期，根据DNA含量直方图，由计算机计算出各时相的分布比率，并计算细胞增殖指数（PI）。为保证仪器的精度和实验条件的稳定性，检测前以flo）荧光微球（REF6605359.Be-ckmanCouiter，Inc.Fullerton，CA92835）作为标准样品调整仪器CV值在2％以内。Caspase3蛋白免疫荧光样品的制备：将1×106个细胞以PBS洗涤2次，2min/次，离心2min，弃上清液

8、，加入1∶100的鼠抗人Caspase3蛋白单克隆抗体100μl，30℃温育30min，用PBS离心洗涤2次，弃上清液，加入1∶100的羊抗鼠FITC-IgG100μl，37℃温育30min，离心洗涤2次取上清液，除去未结合的多余荧光抗体，上机前加